第10章原核生物基因表达的调控

第10章原核生物基因表达的调控10.1原核生物基因调控序列调控序列是调节基因表达的序列，位于基因的侧翼（flankingregion），可对一些特定分子起反应。调控序列并不表达，它所包含的信息是为信号分子提供识别序列并与信号分子相互作用，从而调节附近的结构基因的转录。常见的调控序列有5类：（1）启动子（promoter，P）：启动子是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。常位于结构基因的上游，长度20～200bp。原核生物启动子含有两段共同的保守序列，一个是位于-10区的保守序列TATAAT，由D.Pribnow(1975)发现，故称Pribnowbox；另一个是-35区的保守序列TTGACA。-10区的保守序列是σ因子的结合区，-35区的保守序列是RNA聚合酶的另一个结合区。启动子也可以结合其他调节蛋白而调控转录。（2）操纵子（operator，O）：操纵子位于结构基因和启动子之间，是与阻遏蛋白质结合的一段DNA序列。阻遏蛋白质与操纵子有很强的亲合力，可以阻止RNA聚合酶到达转录起始点。（3）衰减子（attenuator）：衰减子位于前导序列的P-O区与第一个结构基因起始点之间，长度为162bp，它可以微调转录活性，其效果约为10倍。衰减作用并不依赖于阻遏作用，它是由于结构基因转录前体的终止而产生。（4）增强子（enhancer）：增强子是通过增加对所调节基因进行转录的RNA聚合酶的分子数量而提高转录效率的顺式作用因子，它并无特定的位置，在不同的基因中位置是可变的，可以位于基因上下游。增强子可以被序列特异性结合蛋白激活，主要在组织特异性基因表达和发育过程中的基因时序表达中起调节作用。（5）终止子（terminator）：终止子是为RNA聚合酶转录提供终止信号的一段DNA序列。终止子按其作用是否需要蛋白质因子的协助可分成2类：不依赖ρ因子的终止子和依赖于ρ因子的终止子。10.2操纵元的概念及一般结构10.2.1操纵元概念的提出细菌能随环境的变化，迅速改变某些基因表达的状态，这就是很好的基因表达调控的实验模型。人们就是从研究这种现象开始，打开认识基因表达调控分子机理的窗口的。大肠杆菌可以利用葡萄糖、乳糖、麦芽糖、阿拉伯糖等作为碳源而生长繁殖，当培养基中含有葡萄糖和乳糖时，细菌优先使用葡萄糖，当葡萄糖耗尽，细菌停止生长，经过短时间所以适应，就能利用乳糖，细菌继续呈指数式繁殖增长。大肠杆菌利用乳糖至少需要需要两个酶：促使乳糖进入细菌的乳糖透过酶(lactosepermease)和催化乳糖分解第一步的－半乳糖苷酶(-galactosidase)。在环境中没有乳糖或其他-半乳糖苷时，大肠杆菌合成-半乳糖苷酶量极少，加入乳糖2～3分钟后，细菌大量合成-半乳糖苷酶，其量可提高千倍以上，在以乳糖作为唯一碳源时，菌体内的-半乳糖苷酶量可占到细菌总蛋白量的3%。在上述二阶段生长细菌利用乳糖再次繁殖前，也能测出细菌中-半乳糖苷酶活性显著增高的过程。这种典型的诱导现象，是研究基因表达调控极好的模型。针对大肠杆菌利用乳糖的适应现象，法国的Jocob和Monod等人做了一系列遗传学和生化学研究实验，于1961年提出乳糖操纵元（lacoperon）学说。操纵元（operon）是指代谢上相关的一些基因聚合在一起组成一个受共同调控序列控制的转录单元。一个操纵元内的基因在代谢途径上一般都是关联的，其表达也协同地被调节，作为一个转录单位，这样也便于原核生物对外界环境迅速地做出反应。10.2.2操纵元(operon)的基本组成乳糖操纵元模型被尔后的许多研究实验所证实，对其有了更深入的认识，并且发现其他原核生物基因调控也有类似的操纵元组织，操纵元是原核基因表达调控的一种重要的组织形式，大肠杆菌的基因多数以操纵元的形式组成基因表达调控的单元。下面就以半乳糖操纵元为例子说明操纵元的最基本的组成元件（elements）。(1)结构基因群操纵元中被调控的编码蛋白质的基因可称为结构基因(structuralgene,SG)。一个操纵元中含有2个以上的结构基因，多的可达十几个。每个结构基因是一个连续的开放读框(openreadingframe),5′端有翻译起始码，3′端有翻译终止码。各结构基因头尾衔接、串连排列，组成结构基因群。至少在第一个结构基因5′侧具有核糖体结合位点(ribosomebindingsite,RBS)，因而当这段含多个结构基因的DNA被转录成多顺反子mRNA，就能被核糖体所识别结合、并起始翻译。核糖体沿mRNA移动，在合成完第一个编码的多肽后，核糖体可以不脱离mRNA而继续翻译合成下一个基因编码的多肽，直至合成完这条多顺反子mRNA所编码的全部多肽。乳糖操纵元含有ｚ、ｙ和ａ3个结构基因。ｚ基因长3510bp，编码含1170个氨基酸、分子量为135,000的多肽，以四聚体形式组成有活性的β-半乳糖苷酶，催化乳糖转变为别乳糖(allolactose)，再分解为半乳糖和葡萄糖；ｙ基因长780bp，编码有260个氨基酸、分子量为30,000的半乳糖透过酶，促使环境中的乳糖进入细菌；ａ基因长825bp，编码275氨基酸、分子量为32,000的转乙酰基酶，以二聚体活性形式催化半乳糖的乙酰化。ｚ基因5＇侧具有大肠杆菌核糖体识别结合位点（ribosomebindingsite，RBS）特征的Shan-Dagano(SD)序列，因而当乳糖操纵元开放时，核糖体能结合在转录产生的mRNA上。由于ｚ、ｙ、ａ三个基因头尾相接，上一个基因的翻译终止码靠近下一个基因的翻译起始码，因而同一个核糖体能沿此转录生成的多顺反子（polycistron）mRNA移动，在翻译合成了上一个基因编码的蛋白质后，不从mRNA上掉下来而继续沿mRNA移动合成下一个基因编码的蛋白质，一气依次合成这基因群所编码所有的蛋白质。(2)启动子启动子(promoter,P)是指能被RNA聚合酶识别、结合并启动基因转录的一段DNA序列。操纵元至少有一个启动子，一般在第一个结构基因5＇侧上游，控制整个结构基因群的转录。用RNA聚合酶与分离的一段DNA双链混合，再加入外切核酸酶去水解DNA，结果只有被RNA聚合酶识别结合而被保护的那段DNA不被水解，由此可以测出启动子的范围及其序列。虽然不同的启动子序列有所不同，但比较已经研究过的上百种原核生物的启动子的序列，发现有一些共同的规律，它们一般长40～60bp，含A-T碱基对较多，某些片段是很相似的，这些相似的保守性片段称为共有性序列(consensussequences)。如图7-4所示，启动子一般可分为识别（R，recognition）、结合（B，binding）和起始（I，initiation）三个区段。转录起始第一个碱基（通常标记位置为+1）最常见的是A；在—10bp附近有TATAAT一组共有序列，因为这段共有序列是Pribnow首先发现的，称为Pribnow盒（Pribnowbox）；在—35bp处又有TTGACA一组共有序列。不同的启动子序列不同，与RNA聚合酶的亲和力不同、启动转录的频率高低不同，即不同的启动子起动基因转录的强弱不同，例如：PL、PR、PT7属强启动子，而Plac则是较弱的启动子。(3)操纵子操纵子（operator）是指能被调控蛋白特异性结合的一段DNA序列，常与启动子邻近或与启动子序列重叠，当调控蛋白结合在操纵子序列上，会影响其下游基因转录的强弱。以前许多书中将操纵子称为操纵基因（operatorgene）。但现在基因定义是为蛋白质编码的核酸序列，而操纵序列并不是编码蛋白质的基因，却是起着调控基因表达强弱的作用，正如启动序列不叫启动基因而称为启动子一样，操纵序列就可称为操纵子。以前将operon译为操纵子则可改译为操纵元，即基因表达操纵的单元之意。举乳糖操纵元中的操纵子为例，其操纵子（o）序列位于启动子（p）与被调控的基因之间，部分序列与启动子序列重叠。仔细分析这操纵子序列，可见这段双链DNA具有回文（palindrome）样的对称性一级结构，能形成十字形的茎环（stemloop）构造。不少操纵子都具有类似的对称性序列，可能与特定蛋白质的结合相关。阻遏蛋白与操纵子结合，就妨碍了RNA聚合酶与启动子的结合及其后-半乳糖苷酶等基因的转录起始，从而阻遏了这群基因的表达。最早只把与阻遏蛋白结合、起阻遏作用的序列称为操纵子，但其后发现有的操纵元中同一操纵序列与不同构像的蛋白质结合，可以分别起阻遏或激活基因表达的作用，阿拉伯糖操纵元中的操纵序列就是典型的例子。因而凡能与调控蛋白特异性结合、从而影响基因转录强弱的序列，不论其对基因转录的作用是减弱、阻止或增强、开放，都可称为操纵子。(4)调控基因调控基因（regulatorygene）是编码能与操纵序列结合的调控蛋白的基因。与操纵子结合后能减弱或阻止其调控基因转录的调控蛋白称为阻遏蛋白（repressiveprotein），其介导的调控方式称为负调控（negativeregulation）；与操纵子结合后能增强或起动其调控基因转录的调控蛋白称为激活蛋白（activatingprotein），所介导的调控方式称为正调控（positiveregulation）。某些特定的物质能与调控蛋白结合，使调控蛋白的空间构像发生变化，从而改变其对基因转录的影响，这些特定物质可称为效应物（effector），其中凡能引起诱导发生的分子称为诱导剂（inducer），能导致阻遏发生的分子称为阻遏剂或辅助阻遏剂（corepressor）。操纵子对调节蛋白的响应是结构基因被开启或关闭。所谓开启或关闭，最主要的是允许结构基因能产生或阻止产生mRNA。也可能是指mRNA能有效地翻译蛋白质或非常微量地翻译，这是结构基因在二个层次上的调控。这里主要指转录水平上的开启或关闭。所谓“关闭”状态，是表达水平很低，常常会残留、漏渗出很低水平的表达，是基础水平上的表达，细胞内该结构基因只表达1～2个mRNA分子，从关闭到开启常有各种程度的差异，会相差10～100倍，甚至上千倍。例如在乳糖操纵元中，调控基因lacI位于Plac邻近，有其自身的启动子和终止子，转录方向和结构基因群的转录方向一致，编码产生由347个氨基酸组成的调控蛋白R，在环境没有乳糖存在的情况下，R形成分子量为152,000的活性四聚体，能特异性与操纵子ｏ紧密结合，从而阻止利用乳糖的酶类基因的转录，所以R是乳糖操纵元的阻遏蛋白；当环境中有足够的乳糖时，乳糖受-半乳糖苷酶作用转变为别乳糖，别乳糖与R结合，使R的空间构像变化，四聚体解聚成单体，失去与操纵子特异性紧密结合的能力，从而解除了阻遏蛋白的作用，使其后的基因得以转录合成利用乳糖的酶类。在这过程中乳糖（实际起作用的是别乳糖）就是诱导剂，与R结合起到去阻遏作用（derepression），诱导了利用乳糖的酶类基因转录开放。许多调控蛋白都是变构蛋白（allostericprotein），通过与上述类似的方式与效应物结合改变空间构像，从而改变活性，起到调节基因转录表达的作用。(5)终止子终止子（terminator，T）是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。终止子按其作用是否需要蛋白因子的协助至少可以分为两类：一类是不依赖ρ因子（蛋白性终止因子）的终止子，这类终止子在序列上有一些共通的特点，即有一段富含GC的反向重复序列（invertedrepeatsequence），其后跟随一段富含AT的序列（见图7-6），因而转录生成的mRNA的序列中能形成发夹式结构，后继一连串U，正是RNA聚合酶转录生成的这段mRNA的结构阻止RNA聚合酶继续沿DNA移动、并使聚合酶从DNA链上脱落下来，终止转录。另一类是依赖ρ因子的终止子，即其终止转录的作用需要ρ因子的协同，或至少是受ρ因子的影响。不同的终止子的作用也有强弱之分，有的终止子几乎能完全停止转录；有的则只是部分终止转录，一部分RNA聚合酶能越过这类终止序列继续沿DNA移动并转录。如果