法医实验室几种常用DNA提取方法及比较

法医实验室几种常用DNA提取方法及比较(一)Chelex100法原理：Chelex100是一种螯合树脂，由苯乙烯、二乙烯苯共聚体组成，含有成对的亚氨基二乙酸盐离子，起着螯合基团作用，对多价金属离子有极强亲和力。在低离子强度、碱性及100℃煮沸条件下，可以使细胞膜裂解，并使与DNA结合的蛋白质变性，DNA游离。检材基质中一般含有大量金属离子，在低离子强度及加热条件下，金属离子可以辅助脱氧核糖核酸酶降解DNA，也可以抑制PCR反应，所以在提取DNA时，加入Chelex100，螯合了金属离子，防止了DNA降解，提高了PCR扩增成功率。方法：剪取适量血斑、精斑、汗斑、鼻涕斑、指甲、毛根、软组织等等生物检材，置于0.5ml离心管内，加入适量纯水，室温浸泡，13,000rpm离心5min，上清丢弃，管底留约20μl左右液体及检材基质，加入100-200μl5%Chelex100(有时需加适量PK)56℃15min至数10小时不等，100℃8min，13,000rpm离心5mim，上清备用。评述：1、Chelex100法已经成为DNA提取的基本方法，Chelex100法是万能的。目前，我们一切纯化方法都在Chelex100法的基础上进行，Chelex100法又不是万能的。2、Chelex100法提取前的检材清洗非常重要，因为现场检材往往均较脏，脏东西可以抑制PCR反应，所以往往不止清洗一次，清洗检材时可能损失部分DNA。所以应平衡清洗抑制剂与损失DNA之间的关系。特别强调清洗时应“把根留住”，很多情况下已知样本DNA检验失败的原因是把根没有留住。DNA检验时还有另外一句名言：“一个萝卜一个坑”，防止混乱检材。肝素抑制PCR反应，血红素抑制PCR反应，所以长时的浸泡、多次清洗往往可能洗除肝素及血红素。在已知样本多次无检验结果疑为肝素抗凝的情况下，多洗是检验成功所必须的。血红素对普通Taq酶的抑制作用是明显的，而目前mtDNA扩增一般用普通Taq酶，所以同一样品除进行STR检验外尚需进行mtDNA检测时，尽量去除干净血红素，显得尤为重要。现场提取毛发或样本毛发，用毛根进行STR检验时，纯水清洗也非常重要，如果没有清洗干净，毛根DNA本身很少，很易检出为混合型。因为现场毛发及样本毛发很易粘附另一人成份。毛根清洗的特点为振荡洗涤，不离心，多换水。3、清洗后检材中加入5%Chelex100量视检材而定。检材参考加入量0.5×0.5cm血斑150ul-200ul二步法精斑100ul毛根10ul烟头30-50ul4、对于组织，难溶检材，有疑问检材，均可加入终浓度为100ug/ml左右PK，有时间隔一段时间，补加适量PK，PK(蛋白水解酶K)作用最佳pH为8.0。5、加入Chelex100后，56℃浸泡时间，血斑≥15min;组织≥30min，二步法精斑≥1h。6、PCR扩增前应离心。PCR扩增时不应吸入Chelex100，因为Chelex100为PCR抑制剂。7、Chelex100使用浓度5%，有些人用10%，有些人用20%，各人爱好。配制好5%Chelex100pH应在10—11之间，否则应丢弃，不应人为调整Chelex100悬液pH值。(二)有机法原理：有机法提取DNA一般是指用平衡酚(又叫饱和酚)、氯仿等按不同比例混合，采用不同方法提取DNA。DNA易溶于水，不溶于有机溶剂，蛋白质分子表面带有亲水性基因，很容易进行水合作用，并在表面形成一层水化层，使蛋白质分子能够顺利地进入到水溶液中，形成稳定的胶体溶液。在有机溶剂存在的情况下，破坏了蛋白质胶体溶液的稳定性，使蛋白质变性沉淀，离心后，有机溶剂于试管底层(有机相)，DNA继续稳定的存在于上层水相，蛋白质沉淀存在于两相之间。水相中的DNA在大量冷无水乙醇及单价阳离子存在的情况下，水会溶于乙醇中，而DNA从水相中析出，沉淀，通过离心回收。有机法中常用试剂为平衡酚、氯仿，酚及氯仿作用是使蛋白质变性，氯仿的另一作用是有助于水相与有机相分离，并抽提溶于水中(有时达12%)的酚。平衡酚、氯仿及乙醇，三者互溶。方法：剪取适量检材，置于0.5ml离心管内，清洗方法同用Chelex100法提取DNA，加入适量纯水及终浓度为100μg/mlPK，37℃-56℃孵育15min至数10小时，有时间隔一段时间补加适量PK→13,000rpm5min→吸上清于另一管→加入等体积平衡酚→振荡或颠倒彻底混匀→13,000rpm5min→吸上清水相于另一管，加入等体积1：1混合平衡酚：氯仿→振荡或颠倒彻底混匀→13,000rpm5min→吸上清水相于另一管→加入等体积氯仿→振荡或颠倒彻底混匀→13,000rpm5min→吸上清水相于另一管→加入2.5倍体积冷无水乙醇冷冻保存10min以上→13,000rpm5-10min→弃上清→室温凉干或100℃5min烤干→加入10-20μl纯水→室温溶解或100℃5min帮助溶解→离心上清备用评述：1、有机法是经典DNA提取方法，目前国内外仍大量采用，其提取DNA特点为双链，纯度高。2、有机法缺点是应用有毒有机试剂，对人体有害，污染环境；多次换管，容易引起检材污染及编号混乱。有机法提取DNA的另一个缺点是不能去除某些染料，血红素等，而这些恰好是PCR抑制剂。(三)磁珠法原理：(异)硫氰酸胍(GuSCN)是强烈蛋白变性剂，不破坏蛋白质一级结构，能破坏细胞膜及核膜蛋白，并使核酸酶失活，释放DNA。磁珠可以特异性吸附DNA，与DNA结构及片段大小无关。通过洗涤液洗涤，在仅留有特异吸附DNA的磁珠中加入洗脱液，65℃解离后，DNA释放于洗脱液中。方法：5%Chelex100提取DNA上清液或者用裂解液直接提取骨骼、指甲、毛发DNA上清液等约移于0.5ml离心管内→加入结合液100ul，磁珠5ul→振荡混匀，室温5min→在磁架上吸弃上清→加入洗涤液I300ul→振荡混匀→在磁架上吸弃上清→加入洗涤液II300ul→振荡混匀→在磁架上吸弃上清→加入洗涤液II300ul→室温放置2min干燥→加入30-50μl洗脱液，振荡混匀→65℃10min→速于磁架上吸上清于另一新离心管内，备用。评述：1、磁珠法优点是简便、快速，不使用有机溶剂，安全无毒。且经过笔者验证，磁珠法灵敏度非常高，于一根放置月余的带毛囊的毛发中成功提取到DNA且后期的STR分型检测中成功检测到19个位点。由此可见，磁珠法非常适用于微量及疑难检材的DNA提取。2、磁珠法与离心柱法比较，前者简单、方便，转移离心管次数较少，不易污染，而后者则正好相反。3、目前磁珠法已被广泛地用于法医DNA实验中，国内的品牌主要有洛阳惠尔纳米科技有限公司的法医样本DNA试剂盒，该品牌生产的磁珠稳定性、灵敏性均居于世界前列，与国外某些品牌相比提取和纯化效果也毫不逊色。(四)盐析法1988年Miller等报导经典盐析法提取血液DNA，其方法为溶解红细胞后，离心沉渣用PK消化，用大约6M饱和NaCl沉淀蛋白质，离心上清中DNA用无水乙醇沉淀，用TE溶解。(五)NaOH法原理：强碱溶解、变性蛋白质，破坏细胞膜及核膜，变性核酸酶，释放DNA，NaOH不破坏DNA一级结构。方法：1、试剂配制裂解buffer0.2MNaOH中和buffer0.04MTris-HCLpH7.52、实验步骤5μl或1×1mm血斑→加入450μl纯水→室温或37℃15-30min→13,000rpm5min→弃上清→沉淀中加入20μl0.2MNaOH（全血室温5min血斑75℃5min）→加入180μl0.04MTris-HCLpH7.5→振荡混匀，离心上清备用评述：1、一般认为碱性法提取DNA的主要缺点是DNA保存于碱中不稳定，4℃放置24h后PCR扩增往往失败。NaOH法提取DNASTR检测不稳定(4℃保存24h后PCR为阴性)的主要原因是NaOH未完全破坏DNA酶及DNA与蛋白质重新结合。2、碱性法提取DNA的局限性。烟头、邮票、口腔擦拭物、精斑、血斑、指甲等均可用碱性法提取，但是毛根、软组织等不能用NaOH法提取。(六)五种DNA提取方法的比较1、Chelex100法及碱性法的优点是DNA提取时间短，单管，检材不易污染，缺点是提取DNA纯度不高。碱性法与Chelex100法比较，前者成本更低，缺点是提取DNA保存时间短，室温不超过7天，4℃及冷冻保存84天后均无法成功检见Amel及STR位点。因为碱性法及Chelex100法均方便简单，提取DNA时间短，尤其适宜于建立DNA罪犯数据库及已知样本DNA检验。2、有机法及磁珠法优点是提取DNA浓、纯，尤其适宜于特殊生物检材，微量疑难生物检材DNA提取。有机法缺点是提取过程复杂，耗时，多管，检材易污染，及有机试剂污染环境、伤害人体。磁珠法提取简单快捷，安全无毒，且无需频繁移管，检材污染可能性小，尤其适用于微量检材。而且可配合工作站进行全自动操作，大大提高了提取的效率。3、盐析法的优点包括便宜，不用有机试剂。缺点是不易提取微量检材。(七)DNA提取几种常用试剂作用及浓度1、PK破坏蛋白质一级结构，使蛋白质成碎片，贮存浓度一般为5mg/ml，使用终浓度一般为100μg/ml，有时提取骨骼DNA的PK终浓度达5.5mg/ml。PK最佳pH值为8.0。2、SDS既是蛋白变性剂又是表面活性剂(去垢剂)，有变性蛋白质及保护蛋白质的双重作用，所以可以理解PK与SDS混用而不会破坏PK的原因。贮存液浓度10%，使用终浓度一般为1%。Triton、Tween与SDS作用相似。3、EDTA能螯合金属离子，防止脱氧核糖核酸酶降解DNA。