比色法测定乳与乳制品中L

比色法测定乳与乳制品中L(-)-羟脯氨酸的探讨[摘要]目的对比色法测定乳与乳制品中L(-)-羟脯氨酸的方法和样品处理过程进行探讨方法采用12.0mol/L盐酸110(±1)℃恒温消解、过滤后定容、调节pH后按GB/T9695．23-2008加氯胺T氧化、加显色剂、60℃水浴后比色测定，并绘制标准曲线比较定量。结果该法线性范围L(-)-羟脯氨酸在1.0～10.0μg，标准曲线的线性良好，r=0.9995,方法灵敏度为16.2μg/吸光度，检出限48.8μg/g,回收率在80.5%～95.2%，相对标准偏差在2.15%～4.18%。结论比色法测定羟脯氨酸的准确度和精密度良好，能有效地测定乳及乳制品中L(-)-羟脯氨酸含量。L(-)-羟脯氨酸是动物胶原水解蛋白的主要成分之一,其含量占胶原蛋白氨基酸总量的10%以上,被认为是胶原中的特征性氨基酸,而乳蛋白中不含有此成分[1].为了提高乳制品蛋白质含量，不法企业和奶站向奶类制品中添加皮革蛋白粉来提高蛋白质含量。2009年卫生部公布了《食品中可能违法添加的非食用物质和易滥用的食品添加剂品种名单（第二批）》，生鲜乳中添加皮革水解蛋白列为非法。2011-02农业部下发《2011年全国生鲜乳质量安全监测计划》,计划检测项目包括三聚氰胺、皮革水解蛋白和碱类物质。《2011年四川省食品安全风险监测方案》的化学污染物及其有害因素监测内容中增加了对乳及乳制品中非法添加物质-水解蛋白产物-L(-)羟脯氨酸的监测。国标方法目前只有《肉与肉制品L(-)-羟脯氨酸含量测定GB/T9695．23-2008》[1]，还没有乳及乳制品中L(-)-羟脯氨酸的国家标准检测方法出台，在查阅有关文献后对乳及乳制品中L(-)-羟脯氨酸的测定方法进行了探讨。1.材料与方法1.1仪器分光光度计水浴锅恒温干燥箱1.2试剂盐酸（12mol/L及6.0mol/L），乙酸钠缓冲溶液（pH=6.8），氯胺T（1.41%缓冲液），作者单位：乐山市疾病预防控制中心（四川乐山614000）作者简介：杨志琼(1967-)，女，本科，副主任技师，卫生理化检验对二氨基苯甲醛（1.0%高氯酸异丙醇溶液），氢氧化钠溶液（10.0mol/L及1.0mol/L），L(-)-羟脯氨酸标准储备液（500μg/mL），L(-)-羟脯氨酸标准使用液（5.0μg/mL）。1.2方法原理试样经酸水解、释放出L(-)-羟脯氨酸，经氯胺T氧化、生成含有吡咯环的氧化物，用高氯酸破坏过量的氯胺T，L(-)-羟脯氨酸氧化物与对二氨基苯甲醛反应生成红色化合物，在558nm波长处测定吸光度，并与标准比较定量。1.3试样处理1.3.1样品消解称取乳粉2.0g（液体乳20.0g）于50mL具塞比色管中，加15mL12.0mol/L盐酸，再加入1滴苯酚，边充氮气边封口，然后置110(±1)℃恒温干燥箱中恒温6h，同时做试剂空白和加标回收。1.3.2过滤趁热将水解产物用滤纸过滤至100mL容量瓶中，用10mL6.0mol/L盐酸分3次洗涤比色管和滤纸.，滤干后、再用10mL纯水洗涤滤纸和漏斗，并用纯水定容至刻度，此为水解液，摇匀后各取2.0mL至10mL比色管中。1.3.3调节pH用6.0mol/L盐酸和氢氧化钠溶液（10.0mol/L及1.0mol/L）将pH调节至8.0±0.2，再用纯水稀释至10.0mL作为待测液。1.4标准系列吸取L(-)-羟脯氨酸标准使用液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.6、2.0mL（相当于含L(-)-羟脯氨酸0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、8.0、10.0μg）分别置于10mL比色管中，依次向各管中加入纯水至2.0mL。1.5测定吸取1.0mL待测液，置于10mL比色管中并加入纯水至2.0mL，同标准系列各管一起按GB/T9695．23-2008[1]之8.3.2至8.3.7加氯胺T氧化、加显色剂、60℃水浴20min后比色测定，与标准曲线比较定量。2.结果与分析2.1结果所检测的9份样品均检出L(-)-羟脯氨酸,其中奶粉L(-)-羟脯氨酸含量在152.2～191.2mg/kg,液体奶L(-)-羟脯氨酸含量在18.9～20.9mg/kg。2.2分析2.2.1样品消化条件的选择2.2.1.1消解用酸如果按照资料[1]用30mL3.0mol/L硫酸直接放入恒温干燥箱中恒温消解6~12h、容易产生爆沸，样品容易烧干损失，干燥箱内壁也受到酸的腐蚀。此外，样品各管放入恒温干燥箱之前需靠近液面冲入高纯氮气5min、在充氮气状态下封口后再放入恒温干燥箱中消解可避免爆沸。3.0mol/L硫酸消解肉与肉制品等机体复杂、难水解的样品效果很好，乳及乳制品结构和成分相对简单，采用15mL12.0mol/L盐酸消解效果就很好[5]。2.2.1.2消解温度和时间只有资料[1]是针对肉与肉制品用3.0mol/L硫酸105℃恒温干燥箱中恒温6h，文献[3~8]都对乳及乳制品的消解条件进行了优化：15mL12.0mol/L盐酸、110(±1)℃恒温干燥箱中恒温6h。2.2.1.3pH的影响乳品水解产物按照资料[3]调pH至8.0±0.2再稀释后比色测定，同时对比水解液直接稀释后比色测定，结果9份样品直接稀释后比色测得L(-)-羟脯氨酸含量都比调pH后测值低了近乎10倍(表1)，说明样品在强酸性条件下结果会产生假阴性。2.2.2标准曲线2.2.2.1线性范围及灵敏度线性范围为1.0～10.0μg，标准曲线的线性良好，r=0.9996,a=0.004,b=0.0611。灵敏度为16.2μg/吸光度。2.2.2.2方法检出限取空白样品12份按前面方法处理后测定吸光度值为：0.040,0.046,0.040,0.039,0.048,0.036,0.044,0.040,0.044,0.046,0.044,0.049。以空白管吸光度值的3倍标准差算出方法的检出限,即48.8μg/g(以固体样品称样量2.0g计），若液体样品，称样量20.0g，检出限则为4.88μg/g。2.2.2.3平行样品及加标回收向样品中入加L(-)-羟脯氨酸标准储备液（500μg/mL）2.0mL和4.0mL同样品及试剂空白一道按上述方法消解后测定，即样品L(-)-羟脯氨酸加标总量为1000和2000μg，相当于测定时2.0和4.0μg/管的量，结果回收率在80.5%～95.2%,相对标准偏差在1.49%～4.18%，(表2)满足比色法测定乳及乳制品中L(-)-羟脯氨酸的要求。3结论按照文献[2]的判定方法:L(-)-羟脯氨酸是胶原蛋白的特有组分之一,其含量占10%以上,而乳蛋白中不含有此成分,如果样品中含有L(-)-羟脯氨酸、可判定添加了动物水解蛋白。实验结果表明,2011年乐山市食品风险监测所购乳与乳制品样品12份都含有动物胶原水解蛋白。该法准确度和精密度良好，能有效地测定乳及乳制品中L(-)-羟脯氨酸含量。