构建啤酒酵母菌工程菌

JournalofAppliedMicrobiologyISSN1364-5072工程化啤酒酵母细胞利用D-葡萄糖生产1,3-丙二醇Z.Rao,Z.Ma,W.Shen,H.Fang,J.ZhugeandX.WangTheKeyLaboratoryofIndustrialBiotechnologyofMinistryofEducation,ResearchCenterofIndustrialMicrobiology,SchoolofBiotechnologyandStateKeyLaboratoryofFoodScienceandTechnology,JiangnanUniversity,Wuxi,JiangsuProvince,P.R.China摘要目的：在发酵产业中啤酒酵母是一种安全的微生物。1,3-丙二醇是一种广泛用于聚合物生产的重要化学原料，但是由于化学合成成本昂贵，它的实用性受到限制。本研究的目的就是利用工程化啤酒酵母低成本生产1,3-丙二醇。方法与结果：啤酒酵母利用D-葡萄糖作为原料，能够生产丙三醇，而不是1.3-丙二醇。在本研究中，我们克隆了两个基因yqhD和dahB，这两个基因可以使丙三醇转化成1,3-丙二醇，把这两个基因通过农杆菌转化实验整合到啤酒酵母的W303-1A染色体上。这个工程化的啤酒酵母通过功能性yqhD和dhaB基因来实现D-葡萄糖到1,3-丙二醇的生产。结论：啤酒酵母可以被工程化来利用廉价D-葡萄糖原料生产1,3-丙二醇。意义与研究影响：据我们了解，本研究首次利用农杆菌介导的转化来使啤酒酵母生产1,3-丙二醇。该研究可能在1,3-丙二醇生产产业中是一种安全的、低成本的方法。关键词：农杆菌介导法，dhaB基因，丙三醇，1,3-丙二醇，啤酒酵母，yqhD基因前言1,3-丙二醇广泛用于聚合物、化妆品、食品和医药行业，但是由于它的高成本受，应用受到限制。举例来说，1,3-丙二醇最成功的一个应用就是合成聚对苯二甲酸丙二醇酯（PTT），这种材料广泛用于地毯和纺织纤维的制造。作为一种好的聚合物，PTT正广泛扩大它的产业应用，但由于高成本和1,3-丙二醇低实用性的原因而受到限制。1,3-丙二醇主要是通过高成本的化学合成来生产。目前急需一种新的低成本的方法来生产1,3-丙二醇。相比较化学合成，发酵方法有低成本的优势，而且已经广泛用于多种化学行业。理想的发酵生产需要一种能利用可再生资源生产所需化学原料的安全微生物。在自然界中，一些微生物，包括克雷伯氏菌属（Huangetal.2002）,柠檬酸菌属（Boenigketal.1993）和梭菌属（Saint-amansetal.2001）都能生产1,3-丙二醇，但他们都使用昂贵的丙三醇作为原料。在克雷伯肺炎菌中，参与1,3-丙二醇的生物合成的基因是dhaB和dhaT（Fig.1b）DhaB是一种依赖维生素B12的脱水酶，它转化丙三醇到3-羟基丙醛，而DhaT是一种依赖NADH的氧化还原酶，它可以转化3-羟基丙醛到1,3-丙二醇（Skralyetal.1998）。像大肠杆菌，它能利用D-葡萄糖生产丙三醇，可以通过把dhaB和dhaT基因整合到大肠杆菌来生产1,3-丙二醇，但是收率太低（Laffendetal.1997）。已经证实收率低的原因是DhaT活性过低，导致3-羟基丙醛在细胞中堆积。当浓度到达30mmol/l,DhaB的活性就会由于反馈抑制而降低(Barbiratoetal.1996)。在2002年，Emptage等人报道了yqhD基因，一种在大肠杆菌的酒精脱氢酶，有很高的DhaT活性。通过在大肠杆菌中过表达基因dhaB和yqhD，利用YqhD高的活性生产1,3-丙二醇已经被证实(Zhangetal.2005;Wangetal.2007)。啤酒酵母已经用于发酵产业好多年了，主要是由于它使用D-葡萄糖这种低成本原料作为碳源和能源。更进一步，由于大肠杆菌产生内毒素，可能引起疾病，所以啤酒酵母被认为比大肠杆菌更安全。啤酒酵母真的能用来生产1.3-丙二醇吗？这是导致本次研究的问题。野生型啤酒酵母只产生丙三醇，但没有产生1,3-丙二醇的能力（Fig.1a）。在本研究中，我们通过农杆菌介导的转化法把dhaB和yqhD基因整合到啤酒酵母的染色体上，构建一个新的W303-1A-ZR菌株。工程化的啤酒酵母可以利用D-葡萄糖生产1,3-丙二醇（Fig.1c）。该研究可能是一种安全的、有效益的方法来实现1,3-丙二醇的产业化生产。材料和方法材料PCR试剂、限制酶、小牛碱性磷酸酶购于TaKaRa公司（日本）。凝胶提取盒购于Promega（USA）。尼龙膜购于Amersham（伦敦，英国）Southernblot试剂盒购于罗氏。培养基和生长条件本研究中有四种培养基。LB培养基用于大肠杆菌和农杆菌的生长，它包括1%胰蛋白胨，0.5%酵母提取液和1%氯化钠。酵母菌株培养在YPD培养基（1%酵母提取液、2%蛋白胨提取液、2%葡萄糖）。B培养基用于农杆菌介导的转化，它们还是最基本的培养基，添加20ug/ml尿嘧啶，30ug/ml赖氨酸，40ug/ml色氨酸和40ug/ml腺嘌呤（Bundocketal.1995）。共培养培养基（CM）也用于农杆菌介导的转化；它们包含前面提到的尿嘧啶、赖氨酸、色氨酸和腺嘌呤浓度，额外还添加50ug/ml卡那霉素。大肠杆菌JM109培养在LB培养基（添加100ug/ml氨苄青霉素或25ug/ml莱博霉素）。农杆菌LBA4404菌株培养在LB培养基（添加合适的维生素来维持质粒）。发酵条件是有氧环境、摇床250rev/min、30℃。Table1描述了本研究使用的多种细菌菌株和质粒。使用光学密度650nm观察细胞生长，然后转化成菌体干重。DNA片段的PCR扩增除了另外的阐明，PCR扩增在一个50ul混合体系下进行，包含1ng模板、200umol/ldNTP、20umol/l引物和1单位的ExTaqDNA聚合酶。反应先是95℃300秒预变性，随后35个循环包括变性95℃，90秒、退火52℃，120秒、延伸72℃，240秒。第35个循环完成后，72℃，10分钟延伸。反应产物通过0.8%琼脂糖凝胶分离开来，切除想要的条带并纯化。PCR反应通过一个自动化热循环仪图一：工程酿酒酵母利用1,3-丙二醇形成规模化的生物合成途径。(一)野生型s.酵母W303-1A只能从葡萄糖合成甘油。(b)肺炎克雷伯菌可以只从甘油合成1,3-丙二醇。(c)这项研究中设计s.酵母W303-1A-ZR从葡萄糖合成1,3-丙二醇的方案。这可能发现一个安全有效的工业生产1,3-丙二醇的方法。（WhatmanBiometra,Gottingen,Germany）。分别构建包含yqhD基因的pZR1质粒和dahB基因的pZR2质粒质粒pZR1构建方法如下：yqhD基因通过引物P1和P2（Table1）在大肠杆菌基因组中扩增，通过内切酶切下来，整合到载体pGAPZB上，再通过简单的切除和小牛碱性磷酸酶处理。该整合物通过使用氯化钙方法（Ausubeletal.1987）转化到大肠杆菌JM109。在含有25ug/ml博来霉素的LB培养基上，抗博来霉素克隆菌株被筛选出来，并进一步纯化。结果就是得到了指定的JM109-ZR1菌株。然后通过使用碱性溶解法（Sambrooketal.2001）从JM109-ZR1中提取pZR1质粒，通过EcoRI和BglI内切酶证实（Figs2and3）。构建质粒pZR2是一种简单的方法。dhaB基因通过引物P3和P4（Table1）在肺炎克雷伯菌基因组上扩增，通过Xba1内切酶剪切，整合到载体pGAPZB上，再通过简单的切除和小牛碱性磷酸酶处理。整合物转化到大肠杆菌JM109，形成JM109-ZR2。质粒pZR2从JM109-ZR2上纯化，通过XbaI和BamHI内切酶证实(Figs2and3)。表一：用于这项研究的菌株、质粒和引物构建包含yqhD和dhaB基因的质粒pZR4基因yqhD和dhaB整合到载体pCAMBIA3300-zeocin，步骤如下：第一步质粒pZR1被BglII和BamHI剪切下来。DNA片段pGAP-yqhD-AOXlTT包含甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAP）启动子，yqhD和终止子AOXlTT被剪切下并纯化，整合到pCAMBIA3300-zeocin（被BamHI剪切和小牛碱性磷酸酶去磷酸化）。整合物转化到大肠杆菌JM109，形成JM109-ZR3。质粒pZR3从JM109-ZR3纯化下来，通过yqhD基因使用引物P1和P2PCR扩增证实。（Fig.3）下一步，质粒pZR2上的DNA片段pGAP-dhaB-AOXlTT通过引物P5和P6（Table1）扩增，被BglII剪切，纯化，整合到被BamHI剪切的pZR3.然后整合物被转化到大肠杆菌JM109，形成JM109-ZR4.质粒ZR4从JM109-ZR4纯化，被XbaI剪切证实。土壤农杆菌介导的转化土壤农杆菌是一种革兰氏阴性土壤细菌，它能转移一段Ti质粒（T-DNA）到植物细胞或啤酒酵母的染色体上（Bundocketal.1995;Piersetal.1996;Suguietal.2005）。在本研究中，yqhD基因和dhaB基因通过农杆菌介导的转化方法，整合到啤酒酵母的染色体上。第一步，质粒pZR4通过电穿孔转染到农杆菌LBA4404（Marketal.1990），形成LBA4404-ZR4.农杆菌LBA4404-ZR4在含有博来霉素的B培养基上培养过夜，收菌，在B培养基上重悬培养（含或不含100umol/l乙酰丁香酮），生长到1x1011cellml-1，再孵化培养6h。与此同时，啤酒酵母W303-1在摇床30℃下培养过夜，稀释20倍到新鲜的YPD培养基上，培养6h。细胞通过离心收集，用不含乙酰丁香酮的B培养基清洗(Bundocketal.1995)，然后重悬，接种到相同培养基上，最后生长到1x109cellsml-1.随后，50ul啤酒酵母W303-1A和50ul农杆菌LBA4404-ZR4做好前期混合准备，储存在高压蒸汽过的胶膜纸上（直径25mm），上面有固体CM培养基，添加乙酰丁香酮，孵育在28℃，72h。然后，胶膜纸被移到固体YPD培养基（含150ug/ml博来霉素），孵育30℃，3-4days。为了预防供体农杆菌过生长，在培养基中添加了200ug/ml头孢噻肟。啤酒酵母指定的W303-1A-ZR，在30℃，YEPD（含150ug/ml博来霉素）培养基中进一步纯化。图二：构建质粒的研究。流动方向的箭头表示质粒pZR4作用的关键。啤酒酵母染色体上的yqhD和dhaB基因的PCR与印迹杂交分析基因组DNA在整合啤酒酵母W303-1A-ZR上是孤立的（Ausubeletal.1987）。染色体上的yqhD基因的存在是通过使用引物P1和P2的PCR扩增证实的（Table1）。PCR扩增开始是94℃，5min预变性，随后35个循环：94℃变性1min、56℃退火1min、72℃延伸2min。同理dhaB基因通过引物P3和P4的PCR扩增证实。PCR扩增开始是94℃，5min预变性，随后35个循环：94℃变性1min、58℃退火2min、72℃延伸4min。对于印迹杂交分析，基因组DNA用XbaI和EcoRI内切酶剪切，0.8%琼脂糖凝胶电泳分离。DNA被碱液变性，用缓冲液清洗，然后转移到阳离子尼龙膜上(Santangeloetal.1995)。DIG-High标记探针分别通过pZR2的dhaB片段和pZR1的yqhD片段合成。印迹杂交通过使用DIG-High引物DNA标记和检测试剂盒观察。酶试验细胞粗提物通过细胞糊状物声波破碎和离心获得。细胞糊状物是通过发酵培养基离心获得（6000revmin-1,4度10min）。细胞糊状物在20mmol/l的Tris-HCL缓冲液（pH8.0）中清洗,前面转速离心。再用少量适宜的重悬缓冲液重悬。然后细胞在冰上通过声波破碎工作循环60%，周期1s，总共5min。细胞碎