溶菌酶的制备及其性质

实验七溶菌酶的制备及其性质【实验目的】同羧肽酶实验【实验要求】同羧肽酶实验【实验内容】1.溶菌酶Y活性检测⑴酶活力测定方法⑵酶活力单位定义⑶比活力定义⑷蛋白含量测定方法2.蛋清溶菌酶的提取⑴每组4～5个新鲜鸡蛋⑵利用等电点沉淀及树脂层析等方法进行溶菌酶提取3.溶菌酶的分离、纯化⑴利用各种方法，从上述提取液分离⑵每步纯化前蛋白纯度检测⑶分离纯化过程中跟踪检测活性组份的蛋白质含量和酶活性4.溶菌酶理化性质⑴溶菌酶的分子量测定⑵溶菌酶的等电点测定5.溶菌酶的酶学性质⑴在活力单位定义确定后，求出溶菌酶的Vmax和Km⑵初步确定溶菌酶的最适pH⑶初步确定溶菌酶的最适温度⑷提出最少两种溶菌酶的可逆抑制剂并验证抑制类型⑸提出溶菌酶的激活性并验证(6)溶菌酶的热稳定性【实验原理】溶菌酶（lysozyme）是由弗莱明在1922年发现的，它是一种有效的抗菌剂，全称为1，4-β-N-溶菌酶，又称作粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶或胞壁质酶。活性中心为天冬氨酸52和谷氨酸35，是一种糖苷水解酶，能催化水解粘多糖的N-乙酰氨基葡萄糖（NAG）与N-乙酰胞壁酸（NAM）间的β-1，4糖苷键，相对分子质量14700Da，由129氨基酸残基构成，由于其中含有较多碱性氨基酸残基，所以其等电点高达10.8左右，最适温度为50OC，最适PH为6～7左右。在280nm的消光系数[%1cm1A]为13.0。该酶活性可被一些金属离子Cu2+、Fe2+、Zn2+（10-5～10-3M）以及N-乙酰葡萄糖胺所抑制，能被Mg2+、Ca2+（10-5～10-3M）、NaCl所激活。溶菌酶广泛存在于动植物及微生物体内，鸡蛋(含量约为2%～4%)和哺乳动物的乳汁是溶菌酶的主要来源，目前，溶菌酶仍属于紧销的生化物质，广泛应用于医学临床，具有抗感染、消炎、消肿、增强体内免疫反应等多种药理作用。溶菌酶常温下在中性盐溶液中具有较高天然活性，在中性条件下溶菌酶带正电荷，因此在分离制备时，先后采用等电点法，D152型树脂柱层析法除杂蛋白，再经SephadexG-50层析柱进一步纯化。最后用SDS-PAGE鉴定为一条带。采用福林酚法测蛋白含量，分光光度法测定酶活性。【实验材料】1.实验器材循环水式真空泵HSB-IⅡ;蛋白紫外检测仪;记录仪;紫外分光光度计;梯度混合器(500mL);721型光分光光度计;冰冻离心机；冰箱；透析袋；酸度计；部分收集器；恒流泵；圆盘电泳装置；恒温水浴锅；层析柱(2.6×50cm)(1.6×30cm)；布氏漏斗(500mL)；吸滤瓶(1000mL)；G-3砂芯漏斗(500mL)2．实验试剂⑴鸡蛋清（鲜鸡蛋）⑵底物微球菌粉⑶D152大孔弱酸性阳离子交换树脂⑷固体氯化钠（NaCl）；固体硫酸铵(NH4)2SO4；固体磷酸氢二钠（Na2HPO4·12H2O）；固体磷酸二氢钠（NaH2PO4·2H2O）；固体磷酸钠（Na3PO4）⑸乙醇；蒸馏水；甲醇；考马斯亮蓝；三氯醋酸；丙酮(6)溶菌酶标准品；SephadexG50⑺N-乙酰葡萄糖胺；硫酸铜；硫酸亚铁；硫酸锌；氯化镁；氯化钙；氢氧化钠；盐酸⑻SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳试剂（见实验六）；蛋白含量测定（福林法）试剂（见实验二）⑼聚乙二醇-20000、两性电解质【实验操作】1.蛋清的制备将4～5个新鲜的鸡蛋两端各敲一个小洞，使蛋清流出（鸡蛋清pH值不得小于8），轻轻搅拌5分钟，使鸡蛋清的稠度均匀，用两层纱布过滤除去脐带块，量体积约为100ml.2.鸡蛋清粗分离按过滤好的蛋清量边缓慢搅拌边加入等体积的去离子水，均匀后在不断搅拌下用1mol/LHCl调pH值至7左右，用脱脂棉过滤收滤液。3.D152大孔弱酸性阳离子交换树脂层析⑴D152树脂处理：将D152树脂先用蒸馏水洗去杂物，滤出，用1mol/LNaOH搅拌浸泡并搅拌4～8小时，抽滤干NaOH,用蒸馏水洗至近pH7.5,抽滤干,再用1mol/LHCl按上述方法处理树脂，直到全部转变成氢型，抽滤干HCl,用蒸馏水洗致近pH5.5，保持过夜，如果pH之不低于5.0，抽滤干HCl,用2mol/LNaOH处理树脂使之转变为钠型，pH值不小于6.5。吸干溶液，加pH6.50.02mol/L的磷酸盐缓冲液平衡树脂。⑵装柱：取直径1.6cm，长度为30cm的层析柱，自顶部注入经处理的上述树脂悬浮液，关闭层柱出口，待树脂沉降后，放出过量的溶液，再加入一些树脂，至树脂沉积至15～20cm高度即可。于柱子顶部继续加入pH6.5,0.02mol/L磷酸盐缓冲液平衡树脂，使流出液pH为6.5为止，关闭柱子出口，保持液面高出树脂表面1cm左右。⑶上柱吸附：将上述蛋清溶液仔细直接加到树脂顶部，打开出口使其缓慢流入柱内，流速为1ml/min。⑷洗脱：用柱平衡液洗脱杂蛋白，在收集洗脱液的过程中，逐管用紫外分光光度计检验杂蛋白的洗脱情况，当基线开始走平后，改用含1.0mol/LNaCl的pH值6.5，浓度为0.02mol/L磷酸钠缓冲液洗脱，收集洗脱液。⑸聚乙二醇浓缩：将上述洗脱液合并装入透析袋内，置容器中，外面覆以聚乙二醇，容器加盖，酶液中的水份很快就透析膜外的聚乙二醇所吸收。当浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。(6)透析除盐：蒸馏水透析除盐24小时。4.SephadexG50分子筛柱层析⑴装柱：先将用20%乙醇保存的SephadexG50抽滤除去乙醇，用6g/LNaCl溶液搅拌SephadexG50数分钟，再抽滤，反复多次直至无醇味为此。(如果SephadexG50是新的，则按实验五中的方法处理凝胶)。加入胶体积1/4的6g/LNaCl溶液，充分搅拌，超声除去气泡，装入玻璃层析柱（1.6×50cm），柱床45cm。⑵上样：与实验五中的方法相同。⑶洗脱:样品流完后，先分次加入少量6g/LNaCl洗脱液洗下柱壁上的样品，连接恒流泵，使流速为0.5mL/min，用部分收集器收集，每10分钟一管。⑷聚乙二醇浓缩：合并活性峰溶液，用聚乙二醇浓缩到5mL左右时，用蒸馏水洗去透析膜外的聚乙二醇，小心取出浓缩液。⑸透析除盐:蒸馏水透析除盐24小时。收集透析液，量取体积。5.溶菌酶活力测定⑴酶液配制：准确称取溶菌酶样品5mg,用0.1mol/L,pH6.2磷酸缓冲液配成1mg/ml的酶液，再将酶液稀释成50µg/ml.⑵底物配制：取干菌粉5mg加上述缓冲液少许，在乳钵中（或匀浆器中）研磨2分钟，倾出，稀释到15～25ml，此时在光电比色上的吸光度最好在0.5～0.7范围内。5.3活力测定：先将酶和底物分别放入25OC恒温水浴预热10分钟，吸取底物悬浮液4mL放入比色杯中，在450nm波长读出吸光度，此为零时读数。然后吸取样品液0.2mL（相当于10µg酶），每隔30s读1次吸光度，到90s时共计下四个读数。活力单位的定义是：在25℃，pH6.2，波长为450nm时，每分引起吸光度下降0.001为1个活力单位。酶的活力单位数=△A450nm/t×0.001比活力=酶的活力单位数/mg蛋白质6.蛋白质含量的测定采用Folin-酚试剂法进行测定。（参见实验二）7.纯度检测采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法。（参见实验六）8.理化和酶学性质的测定学生可根据酶纯化和活力测定的结果，运用已掌握的生化知识和实验技能自行设计方案进行探索研究。【实验结果】步骤项目体积(ml)总蛋白量(mg)总活力单位比活力(单位/mg)回收率(%)1.制备蛋清2.溶菌酶分离3.D152树脂柱层析4.SephadexG50层析【思考题】1．请说出其它提取和纯化溶菌酶的方法吗？请写出相关的方法及原理。2．根据自身的实验体会，写出优化本实验的措施。Experiment19PreparationofLysozymeandItsProperties【Purpose】ThesameascarboxypeptidaseYexperiment【Requirement】ThesameascarboxypeptidaseYexperiment【Contents】1.Assayoflysozymeactivity⑴Methodofenzymeactivityassay.⑵Thedefinitionofenzymeactivityunit⑶Thedefinitionofspecificactivity⑷Lowrymethodtoquantitateprotein2.Extractionoflysozymeformtheeggwhite⑴Giveeverygroup4～5eggs⑵Extractbysomemethodssuchasisoelectricpointandresinchromatography3.Separationandpurificationoflysozyme(1)Separationlysozymefromabove-mentionedsolutionbyvariousmethods.(2)Assayofproteinpurificationbeforeeverysteptopurify.(3)Assayofproteincontentandenzymeactivityineverystep.4.Thephysicalandchemicalpropertiesoflysozyme(1)Assaythemolecularweightoflysozyme.(2)Assaytheisoelectricpointoflysozyme5.Theenzymaticpropertiesoflysozyme(1)CalculateVmaxandKmoflysozyme(2)FirstmakesuretheoptimumpHoflysozyme(3)Firstmakesuretheoptimumtemperature(4)Proposeatleasttwoinhibitorsoflysozymeandprovetheinhibitionstyle(5)Proposetheactivatorsoflysozymeandthenprovethem(6)Provethestabilityoflysozyme【Principle】Lysozyme,discoveredbytheScottishbacteriologistAlexanderFlemingin1922,isaneffectiveantimicrobialreagentandhydrolyticenzyme,whosefullnameis1,4-β-N-lysozyme,alsocalledmuramidase.TheactivesiteofthisenzymeisAsp62andGlu36.Ithydrolyzestheβ-1,4glucosidiclinkagesbetweenN-acetylmuramicacidandN-acetylglucosaminewhichoccurinthemucopeptidecellwallstructureofcertainmicroorganisms,suchasMicrococcuslysodeikticus.Itcanhydrolyzethepolysaccharideofthecellwallsofgram-negativebacteriaandsomegram-positivebacteria,whichcausethelysisofcellwall.Themolecularweightoflysozymeisabout14700Da,andiscomposedof129aminoacidresidues.Becauseitcontainsmanybasicaminoacids,theisoelectricpointisabout10.8,wheretheoptimumtemperatureisabout50℃.At280nmwavelength,theextinctioncoefficientis13.0.Theinhibitorofl