检测冷却诱导的膜变化对公猪精子获能的影响

检测冷却诱导的膜变化对公猪精子获能的影响摘要：需要对精子功能用快速、灵敏的方法进行评估。由于精子是由不能够受精的卵母细胞经历了一系列复杂的生理变化才获能的，评估精子在体外的受精条件下的功能是合乎逻辑的，在这项研究中，精子在体外条件的能力，是由离子载体和由存储在公猪精液的细胞内钙离子的浓度的变动来进行调控的。在32和20℃稀释公猪精液存储在16和10℃下24和72小时，钙离子载体引起的变化和增加细胞内钙离子的含量在条件下孵化过程中作为时间的函数用流式细胞仪检测和记录的精子的运动能力。所有的反应参数（膜有缺陷的精子顶体反应的精子，细胞与细胞内钙水平高的比例增加）被证明是发生在低储藏温度下敏感微妙的生理变化。精液储存在10℃下精子具有高的钙含量初始水平较高的，但细胞内钙的积累是低于精液存储在16℃下。膜的完整性和和增加的比例高顶体反应细胞精液储存在10℃下在20°C稀释对细胞膜的完整性和反应性没有影响，精液存储在24h和72h的条件下对膜的完整性，顶体反应及细胞内钙能后处理没有明显的差异。然而，在一定程度的细胞凋亡和顶体反应显示储存72h后精子的运动能力加速，特别是当精液储存在10℃下可以得出结论，精子膜反应性和动力学参数的同时使用是一个敏感的工具，用于公猪精液检测与存储相关的膜变化。关键词精子、存储、获能、反应、顶体反应、钙离子内流、动力学1、简介射精后，精子经过一系列复杂的生理变化统称为获能，这使他们能够相互作用和融合卵母细胞[1]。在体外获能处理的前两个小时，大量的钙离子内流发生在公猪精子发生中的外源凝集素结合能力的变化和诱导刺激顶体反应[2-5]。通过施加不同的生理和非生理性刺激可以诱导在精子顶体反应[1]。尽管响应于透明带或透明带蛋白似乎是最像生理诱发和非常有效的公猪精子[6-7]，钙离子载体A23187也可被用于在其他物种中的精子评价[8-11]。由于射出的精子直到完成获能才具备与卵母细胞结合的能力，可以合理地推断精子功能的评估必须在运动状态下充分的评估精子的功能[12]。由于个别男性的敏感性，诱导获能的精子参数的变化，在过去的几年中成为一种广泛使用的来确定精子的功能的诊断工具。然而，关键的记录膜的变化的影响必须进行批判性评估。在女性体内精子存储在输卵管尾部区域[13]仅在有限的时间可以生存。显然，和获能抑制与上皮细胞的相互作用过程中无产能精子可以选择性绑到输卵管，在许多研究中已被证明在各种精子输卵管系统[14-17]。此外，这似乎有可能完成从输卵管释放后获能发生[18-19]。精子获能一直被视为一个涉及一系列积极的,不稳定的事件随后膜变性的过程。在一定的时间段，精子获能后能够高速的蠕动，并进行透明带诱导的顶体反应。在精子大量产生直至排卵维护膜的完整性的必要水平的，精子在很短的时间内发生的不稳定和体外获能过程可能是不连续的。另一方面，获能要完成出现在壶腹排卵后不久的峡部交界处的流体成分的协同作用[18-21]，并且卵母细胞的寿命是有限的，因此，在体外进行的获能变化的能力非常低可能也无法反应体内获能的情况。因此，估计精子反应能力的条件和动力学的检测精子功能的变化是一个有用的工具。然而，除了这样的方法和个别的影响对获能诱导变化的灵敏度，其实用性取决于它的存储引起的条件变化的敏感性。另一个要考虑的因素是采用存储在质膜中引起的变化的参数的灵敏度。对于实验的实用性，最好是使用存储24和72h之间，而不是在同一天收集和使用新鲜精液的稀释液。然而，冷却至低温（5°C），甚至是中度（15°C）的温度诱导获能样的变化[22--23]，而这种现象可能会导致加速影响到随后的一系列获能反应。如果精子膜被保持在一个影响获能条件状态和细胞中，则该维护的期间内使用的精子样品没有明显的限制。在人工授精，公猪精液的稀释和存储过程对精子是一个额外的冲击。公猪精子是由对温度非常敏感的脂质组成的质膜[24-25]，选择合适的温度稀释和存储可能是非常重要的。公猪精液稀释的存储通常在15至17°C。然而，提供稀释的样品，特别是在冬天是受温度变化影响的。这种变化的关键作用只有少数的研究对其进行了评估[26]。因此，本研究公猪的精子在储存过程中的功能状态的影响，稀释温度，储存温度，储存时间延长72小时的响应参数与体外获能（钙离子内流和顶体反应）。2、材料和方法2.1、试剂及方法除另有说明外，试剂由MerckAG,Darmstadt,Germany;AlexisGmbH,Gru¨nberg,Germany;andSigmaAG(Sigma–Aldrich),Steinheim,Germany.等公司购买。使用碳酸氢盐的Tyrode平衡盐溶液（pH值7.4，300mOsm/kg）体系，由96mM的NaCl，3.1mM的KCl，5mM葡萄糖，0.4mM的用MgSO4，15mM的NaHCO3，2mM的CaCl2，0.3mM的的NaH2PO4，1mM丙酮酸钠，21.6mM的乳酸钠，3mg/mlBSA，20mM的Hepes，pH值7.6（台氏培养基;Harrison等人[2]），在39°Ç，在5％CO2中（孵化器）在实验中记录钙离子内流精子获能,在实验中顶体反应用钙离子载体诱导，在培养基中添加用5mM的CaCl2和1mg/mlPVA和PVP代替BSA。2.2、精液来源一共有六份精液从生育能力极强的杂交动物研究获得。这些样品（一般为每周两次）用“戴手套的手”的方法通过无菌纱布（通过清除凝胶）采集。精液采集后立即转移到实验室，预先稀释比为1:1，在32℃和填充剂，以及最终在BTS扩展稀释后储存在32或20℃的浓度为3×107个cellsml和储存在10或16°C24至72小时。2.3、精液的实验处理和常规参数估计从母体射精后不久收集和保存的样本的精液检查精子形态和运动后不久，Petrunkina等人[28]对其进行了评估。洗涤稀释精液的等分试样（在3和5毫升），通过两个步骤的梯度为35和70％的等渗密度生理盐水[2]。除去上清液层后，松散的精子沉淀物再悬浮在剩余70％的生理盐水中至最终浓度为约1×108cells/ml。洗涤后，精液样本被在最低温度为20℃下保存。处理过的样品用洗涤1小时范围内的进行实验研究。2.4、实验方案具体细节每个实验系列的流式细胞仪中的相关章节给出。通用的方案是，如下所示（参见图1）：图、1图试验（见第2节）。洗过的精子悬液，共32个等分，根据稀释温度，储存温度和存储时间对应的4倍和8个不同的稀释温度。这些等分试样培养在完整的碳酸氢盐的Tyrode介质中[2]含有碘化丙啶（2.5微克/毫升）。最终精子细胞浓度为0.8-1×10ml-1。60，120，和180分钟的温育后，钙离子载体A23187（1μM）培养的开始时和之后被添加到八个精子样品中，这些样品进一步温育15分钟。加入FITC标记的PNA（3微克/毫升）的精子悬浮液5分钟，然后加入钙离子载体。在每个采样点，子样本分别取自8个孵化精子悬液以不同的方式处理，并用流式细胞仪检测。荧光FITC-PNA和碘化丙锭的荧光（FL-3，红色荧光，和FL-1，绿色荧光，见下文）的精子顶体反应和膜的完整性方面对膜的状态进行了评价。为检测细胞内钙含量高的人群，生理盐水洗过的精子，结果装有fluo3-AM（1毫摩尔），用HBS稀释，并用蔗糖洗涤介质[2]以从培养基中除去游离的染料。洗过的精子的等分试样中的完整的碳酸氢盐的Tyrode介质含有碘化丙啶（PI）（每个时间点的八个平行孵育）孵育。子样本，从培养细胞悬浮液后20，60，和120分钟，并用流式细胞仪检测。荧光荧光和碘化丙啶荧光检测FL-1（绿色荧光）和FL-3通道（红色荧光）的状态的精子膜中的钙离子内流和细胞膜的完整性进行了评价。2.5、流式细胞仪的测量适当的处理和孵育后，精子悬浮液由FloMax软件所控制的DAKO银河流式细胞仪(DakoCytomationGmbH,Hamburg,Germany)上分析。细胞以约600-1000cells/s的速度通过仪器，收集10,000个细胞数据，使用氩激光细胞激发波长为488nm。在对数刻度尺上PNA-FITC或型Fluo-3的荧光使用520-nm的带通滤波器（FL-1）进行检测，PI荧光使用610nm通滤波器（FL-3）检测。如前所述对机器的设置和调整进行控制，测量精子顶体反应的水平[44]。在公猪精子的钙离子内流的研究中，进行额外的测量进行了调整精子用钙离子载体的培养基中含有的CaCl2（2mM），并且没有碘化丙啶补偿，设置/电压进行了调整，本质是由Harrison等人所描述的[2]。这些设置保持各组内分析在任何给定的一天。2.6、数据监测和分析钙内流和顶体反应相关的数据进行计算作为活细胞群内反应的细胞的百分比（精子顶体反应或与细胞内钙离子水平）。从这个独特的低反应的百分比价值，可运动的细胞可能反应活性高。动力学模型的所有参数对应于具体的治疗和具体的采样点的获能治疗过程中动态监测。简要地说，这种监测方法的优点是，为每个精液的处理和存储有关的8个处理，整个过程中的变化由下式给出一个单一的数学方程（回归）。可以直接进行比较，以评估膜特性的动态（即，以确定和分析的变化率，由分化的模型相关的不同的治疗方法（假设高水平的拟合优度）的近似函数的参数函数）。这种方法的进一步讨论，请参见[16]。以下动能描述的最佳时间比较相对增加，每个特定的膜参数可以选择，，并且对这个时间点有关的数据进行多因素方差分析。在这种方式中明显的时间依赖关系被考虑进去，并且整个过程可以直接进行比较。使用Excel软件和SAS统计软件包（第7版，SASInst.Inc.,Cary,NC,USA).对数据进行分析。为了描述动力学能过程处理的荧光信号的变化强弱，进行了线性和非线性模拟和相应的模型函数的参数的比较（线性和非线性的REG）。使用重复测量方差分析（GLM程序）诸如时间的存储，温度的稀释剂，和存储的温度等影响因素。除非另有说明，否则数据显示为平均值±SEM如果计算出的概率出现这种偶然的几率是小于5％（p0.05），我们认为差异是显着。3、结果3.1、常规精液参数相对于传统的精子学参数，观察到一些明显的差异。（图2）。两个效果的研究（温度的稀释和存储时间）并无对精子运动能力产生影响，然而，样品中的运动性表现为存储在16℃下高于样品储存于10℃（p0.05）。样品储存在16°C正常的顶体的百分比高，（p0.05，然而，所不同的范围为低：〜2-3％）。3.2、主要比较在开始孵化时活性高的精子在培养开始时，24小时后观察膜有缺陷的精子的百分比处理之间没有差异（p0.05）。然而贮存72小时后无论稀释温度是多少膜缺陷的精液中精子的比例为存储在10℃下是显着高于在样品储存在16℃下（图3）。存储在10℃下的精子样品比存储在16℃下的精子样品高钙细胞数量多(p0.05,图.3b)。在开始孵育时活细胞对顶体反应没有显著影响（图.3c)。3.3、公猪精子数的动力学特性的膜参数动态膜缺陷的细胞，细胞钙的含量升高，顶体反应的细胞的比例升高是随时间变化而变化的（p0.05）。所有的治疗精液中存储为24和72小时进行获能条件的时间变化观察。所有的模型功能在附录A（表A.1）。由与细胞内钙的增加，并通过膜的完整性的丧失反射膜参数的变化在图中显示出。图4a和b为在常规的方式处理的精液样本（在32和16℃下）为两个存储周期（24和72小时）。被观察到的整个培养周期（在24小时精液率：直径=0.20和0.08的样品储存于10和16℃下；在72小时精液：直径=0.25和0.14，样品在10和16℃下保存）。有细胞死亡的样品在不同温度下的稀释率没有显着的差异。回归函数显示在24和72h后，随着时间的推移行为是非常相似的，虽然在72小时的精液变化率略有上升（ř=0.14，而ř=0.08，在24小时精液，请参阅附录A）。然而，PI阳性细胞的绝对值在时间周期分析的差异由于精液的年龄引起几乎可以忽略不计的。培养120分钟后观察到精液样本中的死细胞的比例显着增加（存储24小时的精