微生物实验考试

1.显微镜（油镜）的使用方法。1）在使用油镜之前，必须先经低、高倍镜观察，然后将观测目标部分移到视野的中心。（2）将集光器上升到最高位置，光圈开到最大。（3）转动物镜转换器，使高倍镜头离开通光孔，在需观察部位的玻片上滴加一滴香柏油，然后慢慢转动油镜，在转换油镜时，奥秋显微镜网提示：从侧面水平注视镜头与玻片的距离，使镜头浸入油中而又不以压破载玻片。（4）用左眼观察目镜，并慢慢转动细调节器至物象清晰为止。如果不出现物象或者目标不理想要重找，在加油区之外重找时应按：低倍→高倍→油镜程序。在加油区内重找应按：低倍→油镜程序，不得经高倍镜，以免油沾污镜头。（5）油镜使用完毕，先用擦镜纸沾少许二甲苯将镜头上和标本上的香柏油擦去，然后再用干擦镜纸擦干净。2.革兰氏染色步骤及原理。步骤：1.涂片：（1)取载玻片一张，擦净；(2)接种环火焰灭菌，取生理盐水一滴，放在载玻片中央；(3)左手斜持菌种管，右手持接种环，经火焰灭菌后，用右手小指拨开菌种棉塞，管口通过火焰，将接种环插入管中取菌少许；(4)管口再通过火焰，塞好棉塞；(5)将接种环上的细菌加入载玻片上之水滴内，磨匀，涂成直径约1cm大小的薄菌膜；(6)接种环经火焰灭菌。2.干燥：涂片置于空气中，使其自然干燥。3.固定：干燥后将涂片在火焰上缓缓通过3次，此为固定。4.出染：加结晶紫染液于标本上，使其覆满标本，染1~2分钟，细水冲洗。5.煤染：加路哥碘溶液经1分钟，细水冲洗。6.脱色：加95%乙醇溶液于载玻片上，脱色约30秒，倾去酒精，脱色1次，细水冲洗。7.复染：加稀释复红染液复染约1分钟，水洗，待其自然干燥或用吸水纸轻轻吸干。8.镜检：油镜观察。原理：通过结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成了不溶于水的结晶紫与碘的复合物，革兰氏阳性菌由于其细胞壁较厚、肽聚糖网层次较多且交联致密，故遇乙醇脱色处理时，因失水反而使网孔缩小，再加上它不含类脂，故乙醇处理不会出现缝隙，因此能把结晶紫与碘复合物牢牢留在壁内，使其仍呈紫色；而革兰氏阴性菌因其细胞壁薄、外膜层类脂含量高、肽聚糖层薄且交联度差，在遇脱色剂后，以类脂为主的外膜迅速溶解，薄而松散的肽聚糖网不能阻挡结晶紫与碘复合物的溶出，因此通过乙醇脱色后仍呈无色，再经沙黄等红色染料复染，就使革兰氏阴性菌呈红色。3.诱变选育步骤。出发菌株----菌种纯化(出发菌株性能测定)----制备斜面孢子----制备单孢子悬液(悬液进行活菌计数)----诱变剂处理(存活菌数的测定并计算存活率)----平板分离(测定变异率)----挑取变异菌落并移植至斜面上----初筛(初筛数据分析，生产性状的粗测)----斜面传代----复筛(复筛数据分析，精确测定生产性状)----变异菌株(菌株参数分析)----小型或中型投产试验----大型投产试验。4.明胶液化原理及操作。原理：某些细菌可产生一种胞外酶-明胶酶，能使明胶分解为氨基酸，从而失去凝固力，半固体的明胶培养基成为流动的液体。明胶--朊蛋白--蛋白胨--多肽--氨基酸操作：（1）取明胶高层培养基三支，通过穿刺接种法，一支接种大肠埃希菌，另一支接种枯草杆菌，余下一支为对照。（2）置37℃恒温箱中培养24~48小时。（3）将试管置于冰箱或冰浴中30~60分钟。（4）观察结果，明胶培养基呈液化状态者为阳性（+);无液化现象发生者则为阴性（—）。5.淀粉水解原理及操作。原理：某些细菌可以产生分解淀粉的酶，把淀粉水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解后，遇碘不再变蓝色。淀粉--糊精--麦芽糖--葡萄糖操作：（1）将淀粉琼脂平板分成三个区，并在底部做好标记。（2）使用无菌操作，在各个区划线接种适宜的培养物，倒置培养。（3）置37℃恒温箱中培养48小时后，在平皿上滴加碘液，无菌处平皿呈蓝黑色。若细菌生长线周围变成透亮的无色，则为淀粉实验阳性（+），说明该细菌能够产生淀粉酶，将淀粉水解；若细菌生长线四周仍为蓝黑色，表明淀粉不被水解，淀粉水解试验为阴性（—）。