左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上人牙周膜细胞的生长

中国组织工程研究第20卷第34期2016–08–19出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchAugust19,2016Vol.20,No.34P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·高永志，男，1980年生，吉林省人，在职硕士，主治医师，主要从事口腔颌面外科方面的研究。中图分类号:R318文献标识码:A文章编号:2095-4344(2016)34-05082-07稿件接受：2016-05-21牙周膜细胞分离培养与鉴定对照组：单纯人牙周膜细胞实验组：人牙周膜细胞+左旋聚乳酸羟基磷灰石材料观察指标：细胞毒性；碱性磷酸酶活性；Ⅲ型胶原表达情况实验结果：人牙周膜细胞可以在左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上正常生长与增殖，未出现细胞毒性左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上人牙周膜细胞的生长高永志1，殷志远2(1齐齐哈尔医学院附属第一医院口腔科，黑龙江省齐齐哈尔市161041；2黑龙江省建三江七星社区卫生服务中心口腔科，黑龙江省156300)引用本文：高永志，殷志远.左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上人牙周膜细胞的生长[J].中国组织工程研究，2016，20(34):5082-5088.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.34.011ORCID:0000-0001-6584-4958(高永志)文章快速阅读：文题释义：牙周膜细胞：牙周组织中的牙周膜也称牙周韧带，是致密的结缔组织，位于牙根和牙槽骨之间，由细胞、基质和纤维构成。牙周膜细胞是十分重要的细胞之一，具有一定的分化潜能，且生物学性能稳定，因此被广泛大的应用于牙周组织工程之中，成为一种重要的种子细胞。左旋聚乳酸：聚乳酸是一种应用十分广泛的支架材料，具有良好的组织相容性好。在进入体内之后，可以随着时间的推移逐渐发生降解，分解为乳酸，并经过人体的代谢排出体外。聚乳酸由乳酸单体聚合而成，其中左旋聚乳酸是一种重要的类型，属于半结晶体，具备一定的机械强度。摘要背景：在体外构建组织工程化牙周组织过程中，种子细胞与支架材料的有效结合是提高组织工程化牙周组织质量的关键。其中人牙周膜细胞是常用的种子细胞。目的：观察左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上人牙周膜细胞生长情况。方法：体外环境下分离与培养人牙周膜细胞，取第3代细胞，分为2组，设为对照组和实验组，分别予以单纯人牙周膜细胞培养与人牙周膜细胞+左旋聚乳酸羟基磷灰石材料复合培养。培养1，2，3d，检测2组的碱性磷酸酶活性与Ⅲ型胶原表达情况；利用MTT法描绘细胞生长曲线。结果与结论：①经免疫组化染色，培养所得细胞波形蛋白、碱性磷酸酶染色均呈阳性表达，抗角蛋白染色呈阴性，表明所得细胞为实验所需人牙周膜细胞；②经MTT法检测，不同时间点2组细胞毒性的吸光度(A)值经比较差异均无显著性意义(P0.05)；2组人牙周膜细胞的生长曲线形态基本一致；③共培养1，2，3d，2组碱性磷酸酶活性经比较差异均无显著性意义(P0.05)；④2组Ⅲ型胶原A值经比较差异均无显著性意义(P0.05)；⑤结果提示，人牙周膜细胞可以在左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上正常生长与增殖，未出现细胞毒性等不良反应。关键词：生物材料；口腔生物材料；牙周膜细胞；左旋聚乳酸；羟基磷灰石；细胞生长；细胞毒性主题词：牙周膜；羟基磷灰石类；生物相容性材料；细胞毒性，免疫；组织工程人牙周膜细胞在左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上的生长状况高永志，等.左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上人牙周膜细胞的生长ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH5083’sdegree,Attendingphysician,DepartmentofStomatology,FirstAffiliatedHospitalofQiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161041,HeilongjiangProvince,ChinaGrowthofhumanperiodontalligamentcellsonthepoly-L-lacticacidhydroxyapatiteGaoYong-zhi1,YinZhi-yuan2(1DepartmentofStomatology,FirstAffiliatedHospitalofQiqiharMedicalUniversity,Qiqihar161041,HeilongjiangProvince,China;2DepartmentofStomatology,HealthServiceCenterofJiansanjiangQixingCommunityinHeilongjiang,Heilongjiang156300,China)AbstractBACKGROUND:Inconstructingtissue-engineeredperiodontiuminvitto,theeffectivecombinationofseedcellswithscaffoldmaterialsisthekeytopromotethequalityoftissue-engineeredperiodontium,inwhichhumanperiodontalligamentcellsarecommonlyused.OBJECTIVE:Toexplorethegrowthofhumanperiodontalligamentcellsonthepoly-L-lacticacidhydroxyapatite.METHODS:Humanperiodontalligamentcellswereisolatedandculturedinvitro,andpassage3cellswerechosentoberandomlydividedintotwogroups:cellsculturedaloneascontrolgroup,andculturedwithpoly-L-lacticacidhydroxyapatiteasexperimentalgroup.After1,2and3days,alkalinephosphataseactivityandexpressionoftypeIIIcollageninthetwogroupsweredetected,andthecellgrowthcurvewasdepictedusingMTTmethod.RESULTSANDCONCLUSION:Byimmunohistochemicalstaining,culturedcellswerepositiveforvimentinandalkalinephosphatasestainingandnegativeforanti-keratinstaining,indicatingthatthecellswereidentifiedashumanperiodontalligamentcells.ByMTTmethod,therewasnosignificantdifferenceintheabsorbancevalueoftwogroupsatdifferenttimepoints(P0.05).Andafter1,2and3-dayco-culture,thealkalinephosphataseactivitylevelsshowednosignificantdifferencebetweentwogroups(P0.05).Besides,nosignificantdifferenceintheabsorbancevalueoftypeIIIcollagenwasfoundinthetwogroups(P0.05).Toconclude,thehumanperiodontalligamentcellscangrowandproliferatewellonthepoly-L-lacticacidhydroxyapatitescaffoldwithnocytotoxicity.Subjectheadings:PeriodontalLigament;Hydroxyapatites;BiocompatibleMaterials;Cytotoxicity,Immunologic;TissueEngineeringCitethisarticle:GaoYZ,YinZY.Growthofhumanperiodontalligamentcellsonthepoly-L-lacticacidhydroxyapatite.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(34):5082-5088.0引言Introduction在体外构建组织工程化牙周组织过程中，种子细胞与支架材料的有效结合是提高组织工程化牙周组织质量的关键[1-2]。牙周膜细胞是牙周膜中最常见的细胞，其细胞生物学性能稳定，可在一定条件下分化为牙骨质等，并改建牙槽骨，对牙周组织的修复十分重要。理想的支架材料应具备良好的生物相容性，能够为种子细胞的生长提供所需的场所，且不会对细胞生长产生不利的影响[3-5]。聚乳酸是目前应用较广泛的组织工程骨支架材料，它的组织相容性好，对机体无毒副作用，在体内的降解产物是乳酸，通过三羧酸循环可经体内代谢排出[6]。羟基磷灰石具有良好的生物活性，优异的骨传导性能[7-8]，其缺点是脆性较大，而且纯羟基磷灰石不易被吸收，将羟基磷灰石与左旋聚乳酸进行复合，希望强度和生物活性均有所提高。实验在体外分离与培养人牙周膜细胞，取第3代牙周膜细胞作为种子细胞，以左旋聚乳酸羟基磷灰石材料为支架材料，观察人牙周膜细胞在左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上的生长情况，为后续牙周组织工程研究提供理论基础。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计体外观察性实验。1.2时间及地点实验于2015年10至12月在齐齐哈尔医学院附属第一医院实验室完成。1.3材料收集12颗正常恒牙，均来自于齐齐哈尔医学院附属第一医院口腔外科门诊，患者均因正畸拔除恒牙。患者年龄18-31岁，均知情并签署同意书，实验相关情况均经本院医学伦理部门审核通过。恒牙拔出后即刻置于PBS(4℃)中进行浸泡，并迅速送往本院实验室。实验过程中使用的左旋聚乳酸羟基磷灰石生物材料由四川大学生物材料工程研究中心提供。1.4实验方法人牙周膜细胞分离培养与鉴定[9-12]：对恒牙标本进行PBS洗涤，无菌环境下，刮取牙周膜组织，并用眼科剪剪碎，置DMEM培养液(含胎牛血清、链霉素、青霉素)中，置于CO2培养箱中进行培养。观察细胞生长情况，收集第3代对数期细胞，接种于6孔板中，多聚甲醛固定后利用抗兔/鼠通用型免疫组化检测试剂盒，严格按照说明书，按照二步法进行波形丝蛋白、角蛋白染色。并利高永志，等.左旋聚乳酸羟基磷灰石材料上人牙周膜细胞的生长P.O.Box10002,Shenyang110180牙周膜细胞分离培养与鉴定对照组：单纯人牙周膜细胞实验组：人牙周膜细胞+左旋聚乳酸羟基磷灰石材料细胞毒性检测碱性磷酸酶活性检测Ⅲ型胶原表达情况检测用碱性磷酸酶染色试剂盒进行碱性磷酸酶染色，于光镜下对胞质着色情况进行观察。分组处理[13]：将左旋聚乳酸羟基磷灰石材料培养板单孔大小，置于孔中，消毒后添加DMEM培养液。胰酶消化第3人牙周膜细胞后，制备单细胞悬液，细胞浓度5×109L-1，均匀接种在左旋聚乳酸羟基磷灰石生物材料上，接种浓度100μL/块，设为观察组。并以单纯添加相同人牙周膜细胞为对照组，进行相同的培养。细胞毒性检测[14-15]：利用MTT法进行细胞毒性检测，每天收集两组细胞，利用酶标仪对各组在490nm波长的平均吸光度(A)进行检测，并记录检测结果。连续观察10d，每天进行数据记