实验一硫酸苯酚法测多糖含量

实验一硫酸－苯酚法测多糖含量1．目的要求测量蒽酮硫酸法不能测量的血清型的过程样品中的多糖含量2．方法原理糖在浓硫酸作用下，水解生成单糖，并迅速脱水生成糖醛衍生物，然后与苯酚缩合成橙黄色化合物，且颜色稳定，在波长490nm处和一定的浓度范围内，其吸光度与多糖含量呈线性关系正比，从而可以利用分光度计测定其吸光度，并利用标准曲线定量测定样品的多糖含量，本方法可用于多糖、单糖含量的测定。3．主要实验仪器及材料浓硫酸，苯酚，蒸馏装置，分光光度计，电子天平，坐标纸或电脑等。４．掌握要点硫酸显色的安全、准确操作，单糖到多糖的转换系数。５．试剂配制1）葡萄糖标准液的配制准确称取干燥恒重的葡萄糖100mg，蒸馏水准确定容至100mL的1mg/L的葡萄糖液，摇匀后准确吸取10mL该溶液，蒸馏水稀释定容至100mL,即得100ug/mL的葡萄糖标准液。2）90%苯酚液的配制准确移取苯酚90mL，蒸馏水定容至100mL，即得90％苯酚液，棕色瓶中避光保存3）6%苯酚液的配制将90%苯酚液稀释至6%，即一体积储存液对应十四体积纯水，临用现配。6.实验步骤表1标准曲线的制作步骤管号01234567葡萄糖0.00.10.20.30.40.60.81.0苯酚液0.50.50.50.50.50.50.50.5浓硫酸3.03.03.03.03.03.03.03.0取8支干净的具塞试管按表2方法在操作，先在冰水浴中加入0.5ml的苯酚溶液，震荡摇匀后缓慢逐滴加入纯硫酸，以不放热或微量放热为宜，摇匀后恒温加塞沸水放置20min,取出凉水冷却10min,以0号作为空白调零,在最大吸收波长处（490nm）测定吸光度。以葡萄糖浓度X为横坐标（ug/mL），吸光度Y为纵坐标，从而来绘制标准曲线。用exceL软件求得回归方程2）待测样品多糖的测定与计算将提取得到的待测多糖用蒸馏水溶解，定容至100mL,取溶解后的溶液，按标准曲线中的测定方法，以样液为参比液，测定溶液的吸光值，按回归方程计算待测溶液的多糖浓度，注意乘换算系数。二、实验原理游离的己糖或多糖中的己糖基、戊糠醛及己糖醛酸在浓硫酸的作用下脱水生成糠醛衍生物，糠醛衍生物与蒽酮缩合成蓝色的化合物，在620nm处有最大吸收，在一定糖浓度范围内（200ug/ml），溶液吸光度值与糖溶液的浓度成线性关系。用酸将植物组织中没有还原性的多糖和寡糖彻底水解成具有还原性的单糖，或直接提取植物组织中的还原糖，即可对植物组织中的总糖和还原糖进行定量测定。三、实验材料1．可见分光光度计、电子天平(1/100)、粉碎机、水浴锅、电炉。研钵、量筒、三角烧瓶、烧杯、容量瓶、玻璃漏斗、试管1.5cm×15cm、刻度吸管、胶头滴管、pH试纸、坐标纸。四、实验试剂1．蒽酮试剂：取2g蒽酮溶于l000ml体积分数为80％的硫酸中，当日配制使用。2．标准葡萄糖溶液(0.1mg-m1)：称取100mg葡萄糖，溶于蒸馏水并稀释至1000ml（可滴加几滴甲苯作防腐剂）。3．6mol-LHCl溶液：50ml盐酸，加水至100ml。4．10％NaOH溶液：称取10gNaOH固体，溶于蒸馏水并稀释至100ml。五、操作步骤1．葡萄糖标准曲线的绘制取干净试管6支，按下表进行操作。以吸光度为纵坐标各标准液浓度(mg-m1)为横坐标做图。2．样品中还原糖的提取和测定称取植物原料干粉0.1～0.5g，加水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约30ml的蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。于50℃水浴中保温半小时（使还原糖浸出），取出，冷却后定容至100ml。过滤，取lml滤液进行还原糖的测定：吸取lml总糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。（样品液显色后若颜色很深，其吸光度超过标准曲线浓度范围，则应将样品提取液适当稀释后再加蒽酮显色测定）。标准曲线的制作及样品测定参考表1#2#3#4#5#6#7#（样品）8#（样品）标准葡萄糖溶液(ml)00.20.40.60.81.0还原糖总糖蒸馏水(ml)1.00.80.60.40.20样品液(ml)------1.01.0糖溶液浓度(mg/ml)00.020.040.060.080.10待测待测置冰水浴中冷却蒽酮试剂(ml)4.04.04.04.04.04.04.04.0沸水浴中准确加热10min，取出，用自来水冷却，室温放置10minA620nm3．样品中总糖的提取、水解和测定称取植物原料干粉0.1～0.5g，加水约3ml，在研钵中磨成匀浆，转入三角烧瓶中，并用约12ml的蒸馏水冲洗研钵2～3次，洗出液也转入三角烧瓶中。再向三角烧瓶中加入6mol/L盐酸10ml，搅拌均匀后在沸水浴中水解半小时，冷却后用10％NaOH溶液中和pH呈中性。然后用蒸馏水定容至100ml，过滤，取滤液10ml，用蒸馏水定容100ml，成稀释1000倍的总糖水解液。取lml总糖水解液，测定其还原糖的含量：吸取lml总糖类溶液置试管中，浸于冰浴中冷却，再加入4ml蒽酮试剂，沸水浴中准确加热10min，取出用自来水冷却后比色，其他条件与做标准曲线相同，测得的吸光度值由标准曲线查算出样品液的糖含量。六、实验结果按照下列公式分别计算植物原料干粉中还原糖和总糖的质量分数（ω）。ω（还原糖）=（C1V1/m）×100％ω（总糖）=（C2V2/m）×0.9①×100％式中ω（还原糖）：还原糖的质量分数（％）；ω（总糖）：总糖的质量分数（％）；C1：还原糖的质量浓度（mg/ml）；C2：水解后还原糖的质量浓度（mg/ml）；V1：样品中还原糖提取液的体积（m1）；V2：样品中总糖提取液的体积（m1）；m：样品质量（mg）。注①：计算总糖含量的公式，在测定干扰杂质很少、还原糖含量相对总糖含量很少时适用，乘0.9是为了从测定出的总糖水解成的单糖量中，扣除水解时所消耗的水量。七、注意事项1．总糖：食品中的总糖通常是指具有还原性的糖（葡萄糖,果糖,乳糖,麦芽糖等）和在测定条件下能水解为还原性单糖的糖的总量。2．本法适用于可溶性还原糖测定。测定结果是还原性糖和能水解为还原性糖的总和。3．如要求结果中不含淀粉，则样品处理不应用高浓度酸，而应改用80%乙醇。4．如提取液中有较多的可溶性蛋白，必须先除去蛋白。5．若样液较深，可用活性碳脱色。