实验七PCR扩增技术

实验七PCR扩增技术【实验目的】学习PCR方法体外扩增DNA的基本原理，掌握PCR技术的常规操作，了解PCR引物及参数的设计。【实验原理】•多聚酶链式反应(polymerasechainreaction，PCR)的原理类似于DNA的天然复制过程，利用半保留复制的原理，以待扩增的DNA为模板，在体外由引物介导的酶促合成特异DNA片段。•PCR扩增经变性、退火和延伸若干个循环后，DNA扩增2n倍。PCR具体过程•模板DNA的高温变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链的氢键断裂,DNA解离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；•模板DNA与引物的低温退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，使PCR反应体系温度降至50-60℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合•引物的适温延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链,重复循环变性-退火-延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。•上述3步为一个循环，即高温变性、低温退火、中温延伸3个阶段。•从理论上讲，每经过一个循环，样本中的DNA量应该增加一倍，新形成的链又可成为新一轮循环的模板，经过30个循环后，理论上可使DNA扩增至10亿(230=109)倍。•PCR的反应动力学：PCR的三个反应步骤反复进行，使DNA扩增量呈指数上升。反应最终的DNA扩增量可用Y＝(1＋X)n计算。Y代表DNA片段扩增后的拷贝数，X表示平(Y)均每次的扩增效率，n代表循环次数。平均扩增效率的理论值为100%，但在实际反应中平均效率达不到理论值。•反应初期，靶序列DNA片段的增加呈指数形式，随着PCR产物的逐渐积累，被扩增的DNA片段不再呈指数增加，而进入线性增长期或静止期，即出现“停滞效应”，这种效应称平台期数、PCR扩增效率及DNA聚合酶PCR的种类和活性及非特异性产物的竟争等因素。大多数情况下，平台期的到来是不可避免的。•PCR反应五要素参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。引物：引物是PCR特异性反应的关键，PCR产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。酶及其浓度：目前有两种TaqDNA聚合酶供应，一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的PCR反应约需酶量2。5U(指总反应体积为100ul时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。•dNTP的质量与浓度：dNTP的质量与浓度和PCR扩增效率有密切关系，dNTP粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。•模板(靶基因)核酸：模板核酸的量与纯化程度，是PCR成败与否的关键环节之一，传统的DNA纯化方法通常采用SDS和蛋白酶K来消化处理标本。•Mg2+浓度：Mg2+对PCR扩增的特异性和产量有显著的影响，在一般的PCR反应中，各种dNTP浓度为200umol/L时，Mg2+浓度为1.5～2.0mmol/L为宜。PCR反应的关键环节•①模板核酸的制备，②引物的质量与特异性，③酶的质量及，④PCR循环条件。寻找原因亦应针对上述环节进行分析研究。•模板：①模板中含有杂蛋白质，②模板中含有Taq酶抑制剂，③模板中蛋白质没有消化除净，特别是染色体中的组蛋白，④在提取制备模板时丢失过多，或吸入酚。⑤模板核酸变性不彻底。在酶和引物质量好时，不出现扩增带，极有可能是标本的消化处理，模板核酸提取过程出了毛病，因而要配制有效而稳定的消化处理液，其程序亦应固定不宜随意更改。•酶失活：需更换新酶，或新旧两种酶同时使用，以分析是否因酶的活性丧失或不够而导致假阴性。需注意的是有时忘加Taq酶或溴乙锭。•引物：引物质量、引物的浓度、两条引物的浓度是否对称，是PCR失败或扩增条带不理想、容易弥散的常见原因。有些批号的引物合成质量有问题，两条引物一条浓度高，一条浓度低，造成低效率的不对称扩增，对策为：①选定一个好的引物合成单位。②引物的浓度不仅要看OD值，更要注重引物原液做琼脂糖凝胶电泳，一定要有引物条带出现，而且两引物带的亮度应大体一致，如一条引物有条带，一条引物无条带，此时做PCR有可能失败，应和引物合成单位协商解决。如一条引物亮度高，一条亮度低，在稀释引物时要平衡其浓度。③引物应高浓度小量分装保存，防止多次冻融或长期放冰箱冷藏部分，导致引物变质降解失效。④引物设计不合理，如引物长度不够，引物之间形成二聚体等。•Mg2+浓度：Mg2+离子浓度对PCR扩增效率影响很大，浓度过高可降低PCR扩增的特异性，浓度过低则影响PCR扩增产量甚至使PCR扩增失败而不出扩增条带。•反应体积的改变：通常进行PCR扩增采用的体积为20ul、30ul、50ul。或100ul，应用多大体积进行PCR扩增，是根据科研和临床检测不同目的而设定，在做小体积如20ul后，再做大体积时，一定要模索条件，否则容易失败。PCR常见类型1、巢式PCR：采用两对引物进行PCR，其中第二对引物位于第一对引物内。2、不对称PCR：采用两种不同浓度的引物。分别称为限制性引物和非限制性引物,其最佳比例一般是0.01∶0.5μM,关键是限制性引物的绝对量。3、反向PCR：是用反向的互补引物来扩增两引物以外的DNA片段对某个已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增。4、等位基因专一PCR：该法可用于检测点突变。如用于检测镰刀形贫血症。•5、竞争引物PCR：有一个碱基变化的两种引物在较宽松的复性条件下竞争DNA模板，其中只有完全互补的引物才能大量配对。该法可用于测定某一DNA片段上是否带有某一已知碱基置换。•6、多重PCR：用于检测特定基因序列的存在或缺失。•7、原位PCR：直接用细胞涂片或石蜡包埋组织切片在单个细胞中进行PCR扩增。可进行细胞内定位和检测病理切片中含量较少的靶序列。•8、差示PCR：利用特殊设计的引物，在RT的基础上进行PCR，以研究不同基因的表达状况。•9、实时定量PCR：实时定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，最后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法，实时荧光定量PCR是目前确定样品中DNA(或cDNA)拷贝数最敏感、最准确的方法。【实验试剂】•DNA模板;•Taq酶，扩增缓冲液，ddH2O;•琼脂糖N;•DNA分子量标准;•50TAE电泳缓冲液(储存液);•6*loadingbuffer;•溴化乙锭溶液(EB)：0.5mg/ml；•引物(20M)：【实验步骤】在0.2ml的PCR薄壁管里按以下比例配置50l反应体系：•模板DNA0.5l•上游引物1l•下游引物1l•10扩增缓冲液5l•dNTP4l•Taq酶0.5l•ddH2O38l•混匀，瞬时离心，按以下条件设计好程序，进行PCR反应；•95oC预变性3min；30个循环95oC变性30s55oC退火30s72oC延伸1min72oC终止延伸10min•PCR反应结束后，取5l样品，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物【结果示例】泳道M:DNAmaker;泳道1,2:1500bpPCR产物;泳道3,4:750bpPCR产物【注意事项】•PCR反应灵敏度很高，为了防止污染，使用的0.2ml的PCR薄壁管和吸头都应该是无污染的。•加试剂前，应短暂离心10s，然后再打开试剂的管盖，以防止污染试剂。•配置PCR反应体系时，Taq酶应该最后加入。使用工具酶的操作必须在冰浴的条件下进行，使用后应立即将工具酶放回冰箱。•dNTP不仅提供DNA复制的原料，还提供反应过程中所需要的能量。通常dNTP应分装小管，存放于-80度或-20度冰箱中，避免过多的冻融，否则会使dNTP的高能磷酸键打开。•当扩增大于5kb的目的片段时，可以使用用于超长PCR的酶或酶混合物以获得最佳产量。防止残余（Carry-over）污染。•PCR易受污染的影响，因为它是一种敏感的扩增技术。小量的外源DNA污染可以与目的模板一块被扩增。当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染。这称之为残余污染。•残余反应成分包括抑制克隆，测序和标记反应的引物，核苷和热稳定聚合酶。因此，一般在进一步操作之前需要纯化PCR产物。【思考题】•PCR扩增如果出现非特异性条带，可能是由哪些原因造成的？•简述PCR技术的原理及各试剂的作用(Mg2+、dNTP、引物、DNA模板、缓冲液)。•给你一个基因片段，如何设计PCR引物？PCR引物的要求是什么？•实验过程中如果没有获得PCR产物，请分析原因。