实验五激活剂

实验五激活剂、抑制剂、温度及PH对酶活性的影响一、目的要求通过实验加深对酶性质的认识，了解测定α-淀粉酶活力的方法。二、实验原理酶是生物体内具有催化作用的蛋白质，通常称为生物催化剂。酶催化的反应称为酶促反应。生物催化剂催化生化反应时具有：催化效率好、有高度的专一性、反应条件温和、催化活力与辅基，辅酶，金属离子有关等特点。能提高酶活力的物质，称为激活剂。激活剂对酶的作用有一定的选择性，其种类多为无机离子和简单的有机化合物。使酶的活力中心的化学性质发生变化，导致酶的催化作用受抑制或丧失的物质称为酶抑制剂。氯离子为唾液淀粉酶的激活剂，铜离子为其抑制剂。应注意的是激活剂和抑制剂不是绝对的，有些物质在低浓度时为某种酶的激活剂，而在高浓度时则为该酶的抑制剂。如氯化钠达到约30%浓度时可抑制唾液淀粉酶的活性。酶促反应中，反应速度达到最大值时的温度和PH值称为某种酶作用时的最适温度和PH值。温度对酶反应的影响是双重的：一方面随着温度的增加，反应速度也增加，直至最大反应速度为止；另一方面随着温度的不断升高，而使酶逐步变性从而使反应速度降低。同样，反应中某一PH范围内酶活力可达最高，在最适PH的两侧活性骤然下降，其变化趋势呈钟形曲线变化。食品级α-淀粉酶是一种由微生物发酵生产而制备的微生物酶制剂，主要由枯草芽孢杆菌、黑曲霉、米曲霉等微生物产生。但不同菌株产生的酶在耐热性、酶促反应的最适温度、PH、对淀粉的水解程度，以及产物的性质等均有差异。α-淀粉酶属水解酶，作为生物催化剂可随机作用于直链淀粉分子内部的α-1,4糖苷键，迅速地将直链淀粉分子切割为短链的糊精或寡糖，使淀粉的粘度迅速下降，淀粉与碘的反应逐渐消失，这种作用称为液化作用，生产上又称α-淀粉酶为液化淀粉酶。α-淀粉酶不能水解淀粉支链的α-1,6糖苷键，因此最终水解产物是麦芽糖、葡萄糖和α-1,6键的寡糖。本实验通过淀粉遇碘显蓝色，糊精按其分子量的大小遇碘显紫蓝、紫红、红棕色，较小的糊精（少于6个葡萄糖单位）遇碘不显色的呈色反应，来追踪α-淀粉酶作用于淀粉基质的水解过程，从而了解酶的性质以及动力学参数。三、激活剂和抑制剂对唾液淀粉酶活力的影响（一）试剂及材料1、1：30唾液淀粉酶配置用蒸馏水漱口，1min后收集唾液，以1：30倍蒸馏水稀释。2、0.2%可溶性淀粉3、1%NaCl溶液4、1%CuSO4溶液5、标准稀碘液吸取（二）仪器设备电热恒温水浴锅。（三）操作方法取试管3根，编号后按下表配置实验样液。试管序号0.2%可溶性淀粉1%NaCl1%CuSO4蒸馏水混匀，放入37℃水浴中保温10min。立即加入唾液淀粉酶。1：30唾液淀粉酶不显蓝色所需时间12.0mL1.0mL//1.0mL2’30min22.0mL/1.0mL/1.0mL超过15min32.0mL//1.0mL1.0mL4’39min用点滴管并不断从试管中吸取样液于比色白瓷板，用稀碘液检验试管内淀粉被淀粉酶水解的程度，记录各试管内样液遇碘不显蓝色的先后顺序，解释实验现象的原因。四、温度与PH值对α-液化淀粉酶活力的影响（一）试剂与材料1、2%可溶性淀粉溶液称取可溶性淀粉2.0g（预先在105℃烘干），预加20mL蒸馏水调匀，然后倾入80mL沸水中煮沸至溶液透明，冷却后定容至100mL。2、PH4.0、5.0、6.0、7.0、8.0磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲溶液（1）0.2mol/mLNa2HPO4称取35.60gNa2HPO4.2H2O，用水溶解定容至100mL。（2）使用酸度计，用柠檬酸调整至所需的PH值。3、供试酶液的制备称取固体α-液化淀粉酶1.00g，加入PH6.0磷酸氢二钠–柠檬酸缓冲溶液100mL(缓冲液的加入量视酶活力大小而定，控制酶解反应在5-10min内完成)，于40℃恒温水浴中活化0.5小时，然后用3000rpm/min离心机离心分离5min，酶提取液于冰箱保存，供试验用。4、标准比色液甲液：称取氯化钴（CoCl.6H2O）40.2439g、干燥重铬酸钾0.4748g，溶解并定容至500mL。乙液：称取铬黑T40.00mg，溶解并定容至100mL。使用时取甲液40.0mL、乙液5.0mL，混合。混合比色液宜放置冰箱保存，使用7天后重新配置。5、标准稀碘液。（二）仪器设备电热恒温水浴锅。（三）操作方法1、用滴管吸取一定量标准比色液于白色瓷比色板空穴中，作为判断酶解反应终点的标准色。2、不同温度对α-液化淀粉酶活力的影响取4根Φ25×200mm试管，按下表配制反应溶液。试管序号12342%可溶性淀粉20.0mL20.0mL20.0mL20.0mLPH6.0缓冲液5.0mL5.0mL5.0mL5.0mL把四根试管分别放入50℃、60℃、70℃、80℃恒温水浴中预热10min分别加供试酶液0.5mL0.5mL0.5mL0.5mL反应完成时间记录（min）50℃60℃70℃80℃5’375’03超过15超过15加入供试酶液后，立即用秒表或手表记时，充分要匀，定时用点滴管从各反应试管中分别吸取1-2滴反应液，滴入预先盛有2/3稀碘液的比色白瓷板孔穴内，从淀粉遇碘显色的变化情况，跟踪淀粉在淀粉酶作用下被水解的过程，当穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色，与标准比色液的颜色相同时，即达反应终点，记录酶解反应完成所需时间。3、不同PH值对α-液化淀粉酶活力的影响取5根Φ25×200mm试管，按下表配制反应溶液。试管序号2%可溶性淀粉缓冲溶液恒温水浴60℃预热10min。供试酶液反应完成时间记录（min）120mLPH4.05.0mL0.5mL2’46320mLPH6.05.0mL0.5mL3’53420mLPH7.05.0mL0.5mL6’10520mLPH8.05.0mL0.5mL6’51其它操作与温度对酶活力影响实验相同。五、结果计算和讨论淀粉酶活力单位定义为在一定条件下，1g酶制剂1小时内液化可溶性淀粉的克数。酶活力单位(U/g)=nt5.0102.02060(n——酶制剂稀释倍数,取200)式中：20——可溶性淀粉的用量（mL）；t——酶解反应完成所需的时间（min）；0.5——测定时稀释酶液用量（mL）；0.02——可溶性淀粉溶液的浓度（g/mL）；1、不同温度对α-液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果50℃60℃70℃80℃酶活力（U/g）894954320320温度—酶活力单位图2、不同pH值对α-液化淀粉酶活力影响的结果记录实验结果pH4.0pH6.0pH7.0pH8.0酶活力（U/g）19511359786737PH值—酶活力单位。020040060080010001200020406080100yy050010001500200025000246810yy讨论分析实验结果。由第一个实验可验证激活剂与抑制剂对反应速度的影响，其中的常见的激活离子:①无机阳离子，如钠离子、钾离子、等；②无机阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子等；实验试剂取NaCl溶液与淀粉酶反应，可见反应速率是最快的，因为当中的钠离子与氯离子都可促反应的发生。导致溶液不显蓝。对于抑制剂对酶促反应速度的影响，是可以减弱、抑制甚至破坏酶活性的物质称为酶的抑制剂。它可降低酶促反应速度。可见CuSO4的不显色时间已经超过15分钟，酶己娙失效。结论为低浓度的CuSO4是抑制剂，低浓度的NaCl是激活剂。第二个实验，影响酶促反应速度的因素：[S]、[E]、pH、温度、激活剂与抑制剂，过酸过碱都能使酶蛋白变性而使其丧失活性。在不致使变性的pH值范围内，酶的活性会因pH值不同而不同。每种酶均有各自的最适温度和最适pH值，如符合这最适条件，酶的活性便最高。相反，偏离这最适条件，酶变的不活跃。由温度—酶活力单位图可见，最适温度为在60℃，低于适当的温度会使酵素失去活性，但是升高温度后可以恢复酵素活性。当温度达到60～80℃时，大部分酶被破坏，发生不可逆变性；由PH值—酶活力单位可见，淀粉酶在pH4中具有最好活性，酶在最适pH范围内表现出活性，大于或小于最适pH，都会降低酶活性。并由图可见，到了pH7,8中性时已经较pH4时活性下降了不少，由此可判断淀粉酶在微酸性时活性高。但正常的酶的变化趋势呈钟形曲线变化，而人体的消化酶ph值大概在6~8，微酸和微碱，可推断这次实验的结果有误差，可推测是人为计时有问题，因为溶液的调配没有问题。，我们应该从放下酶的时候开始计数，估计误差出在溶液滴入比色皿才开始计时，导致显色时间缩短，导致误差。六、思考题1、从实验操作技能方面考虑，做好本实验的操作要点是什么？要注意的是，时间的计时方面，因为溶液众多，许多同学为了加快完成实验，导致计时失误，因为这次计酶的活性就体验在显色的时间，时间是关键。两个人的配合很重要，分工要明确，不然会导致不停重做。另外需在下酶就开始计时，并隔一会就滴另一个格，观察显色。记好格是属于那个溶液，不要贪快同时做几支试液，很易搞混。在温度对酶的影响时，因为为了方便，同枱的四个炉一齐运作，每个炉有不同温度，又因炉的功能简单，需要留意着温度计，因为如果不留神就会令烧杯升温或降温，影响酶的活性。在计pH值对酶影响时，因为四支溶液共浴在一个60度的烧杯中，建议在试管做好标记，虽然结果会呈钟形，可推判出那个支的pH值，但会影响实验的准确度。4、用酶前对酶进行活力进行测定，对实验有何实际指导意义？1可以确定酶是否可用2使用酶的时候提供参考，以便明确具体要使用多少酶用于底物的催化。