实验六微生物的简单染色及革兰氏染色

实验六微生物的简单染色及革兰氏染色利用显微镜对微生物细胞形态、结构、大小和排列进行观察前，首先要将微生物样品置于载玻片上、染色，为观察到真实、完整的生物形态结构，根据不同微生物的特点采取不同的制片及染色方法。微生物细胞个体微小且较透明，在光学显微镜下难以将其与背景区分开而看清。所以，在利用光学显微镜对微生物进行观察前，需要利用染料对微生物进行染色，使着色细胞或结构与背景形成鲜明对比，以便更清晰地观察微生物细胞形态及结构特征。微生物的另一个特点是种类繁多，不同微生物细胞结构各异，对各类细胞染料的结合能力不同，研究者必须根据所要观察的微生物特点及观察目标，选用适宜的染色技术。（一）细菌、放线菌、酵母菌和霉菌的制片和简单染色一、目的要求1.学习并掌握微生物制片及简单染色的基本技术。2.初步了解细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的形态特征和相互区别。3.巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。二、基本原理对个体较小的细菌进行制片时采取涂片法，通过涂抹细胞个体在载玻片上均匀分布，避免菌体堆积而无法观察个体形态，通过加热固定使细胞质凝固，使细胞固定在载玻片上，这种加热处理还可以杀死大多数细菌而且不破坏细胞形态。利用单一染料对菌体进行染色的方法称为简单染色。用于染色的染料是一类苯环上带有发色基团和助色基团的有机化合物。发色基团赋予染料颜色特征，而助色基团使染料能够形成盐。不含有助色基团而仅具有发色基团的苯化合物（色原）即使具有颜色也不能用作染料，因为它不能电离，不能与酸或碱性成盐，难以与微生物细胞结合使其着色。常用的微生物细胞颜料都是盐，分碱性染料和酸性染料，前者包括美蓝（亚甲蓝）、结晶紫、碱性复红、沙黄（番红）及孔雀绿等，后者包括碱性复红、伊红及刚果红等。通常采用碱性染料进行染色，原因在于微生物细胞在碱性、中性及弱酸性溶液中常带负电荷，而染料电力红染色部分带正电荷，很容与细胞结合使其着色；当细胞处于弱酸条件下（如细菌分解糖类产酸）所带正电荷增加时，可采用酸性染料染色。三、实验器材与试剂1.菌种：枯草芽胞杆菌12-18小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌24小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。2.溶液和试剂：草酸铵结晶紫染液、齐氏石炭酸复红染液、吕氏碱性美蓝染液、革兰氏染色用碘液、乳酸石炭酸棉蓝染液。3.仪器和其他用品：酒精灯、载玻片、盖玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸和接种环、接种铲、接种针、镊子、载玻片夹子、载玻片支架、玻璃纸、平皿、U型玻璃棒、滴管、解剖针、解剖刀、生理盐水50%乙醇、20%甘油、高氏一号培养基平板、马铃薯琼脂薄层平板等。四、操作步骤安全警示1.加热固定时要使用载玻片夹子，以免烫伤。不要将载玻片在火焰上烧烤时间过长，以免载玻片破裂。2.使用燃料时避免占到衣服上。3.进行放线菌和霉菌制片时减少空气流动，避免吸入孢子。4.实验完毕后洗手，金黄色铺头球菌为条件致病菌，二甲苯为有毒物质。（一）细菌制片及简单染色1.涂片取一块载玻片，用记号笔平均分为两个区域标记；各滴一小滴生理盐水与两个区域中央；用接种环无菌操作分别有枯草芽胞杆菌营养琼脂斜面和金环色葡萄球菌营养琼脂细面挑取适量菌苔，将占有菌苔的接种环置于载玻片上的生理盐水中涂抹，使菌悬液在载玻片上形成均匀薄膜。若用液体培养物涂片，可用接种环蘸取1-2环菌液直接涂于载玻片上。2.干燥自然干燥或用电吹风干燥。3.固定涂菌面朝上，通过火焰2-3次。4.染色将载玻片平放于载玻片支架上，滴加染液覆盖图菌部位即可，吕氏碱性美蓝染液1.5分钟，结晶紫染液或齐氏石碳酸复红染液1分钟。5.水洗倾去染液，自来水冲洗，水流不宜过急、过大，不要直接冲涂片处，至洗出水无色为止。6.干燥用吸水纸洗去过多水分，自然干燥或电吹风吹干。7.镜检将制备好的样片置于显微镜下进行观察、记录。获得本实验成功关键1.涂片时取菌量要适宜且要涂抹均匀，避免贪多造成菌体堆积而难以看清细胞具体形态。同时也应避免取菌量太少而难以在显微镜视野中找到细胞。2.无菌操作取菌时一定要等接种环冷却后再取菌，以免高温时菌体变形。3.必须等涂片干燥后加热固定，避免加热时间过长，否则细胞会破裂或变形。(二)革兰氏染色法一、目的要求1、学习并掌握革兰氏染色法2、了解革兰氏染色原理。3、巩固显微镜操作技术及无菌操作技术。二、基本原理革兰氏染色法可以将细菌分成革兰氏阳性和革兰氏阴性两种类型，这是由这两种细菌细胞壁结构和组成的差异所决定的。首先利用草酸铵结晶紫初染，所有细菌都会着上结晶紫的蓝紫色。然后利用卢戈氏碘液作为媒染剂处理，由于碘与结晶紫形成碘-结晶紫复合物，增强了染料在菌体中的滞留能力。之后用95%乙醇作为脱色剂进行处理时，两种细菌的脱色效果不同。阳性细菌细胞壁上肽聚糖含量高，壁厚且脂质含量低，肽聚糖本身并不结合染料，但其所具有的网孔结构可以滞留碘-结晶紫复合物，现在一般认为乙醇处理可以使肽聚糖网口收缩而使碘-结晶紫复合物滞留在细胞壁，菌体保持原有的蓝紫色。而革兰氏阴性细菌细胞壁肽聚糖含量低，交联度低，壁薄且脂质含量高，乙醇处理时脂质溶解，细胞壁通透性增加，原先滞留在细胞壁中的碘-结晶紫复合物容易被洗脱下来，菌体变为无色，用复染剂（如番红）染色后又变为复染剂颜色（红色）三、实验器材与试剂1.菌种：大肠杆菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物、金黄色葡萄球菌16小时牛肉膏蛋白胨琼脂斜面培养物。2.溶液和试剂：革兰氏染液、草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液95%乙醇、番红复染液等。3.仪器和其它用品：酒精灯、载玻片、显微镜、双层瓶（内装香柏油和二甲苯）、擦镜纸、接种环、试管架、镊子、载玻片夹子、载玻片支架、滤纸、滴管和无菌生理盐水等。本实验为什么采用上述生物？大肠杆菌是革兰氏阴性杆状细菌，金黄色葡萄球菌是革兰式阳性球状细菌，经过革兰氏染色，两者着不同染色，同时，由于两者具有不同的个体形态，在它们的混合图片上进行革兰氏染色后，根据菌体颜色和形态差异，可以判断染色是否成功。四、操作步骤1、制片取活跃生长期菌种按常规方法涂片（不宜过厚）、干燥和固定。2、初染低价草酸铵结晶紫染液覆盖图菌部位，染色1-2min红倾去染液，水洗至流出水无色。3、媒染先用卢戈氏碘液冲去残留水迹，在用碘液覆盖1min，倾去碘液，水洗至流出水无色。4、脱色将玻片上残留水用吸水纸吸去，在白色背景下用滴管流加95%乙醇脱色（一般20-30s）当流出液体无色时立即用水洗去乙醇。5、复染将玻片上残留水用吸水纸吸取，用番红复染液染色2min，吸去残水晾干。6、镜检油镜观察。7、混合涂片染色在载玻片同一区域用大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片，其他步骤如上。获得本实验成功的关键1、选用活跃期菌种染色，老龄的革兰氏阳性细菌会被染成红色而造成假阴性。2、涂片不宜过厚，脱色不完全造成假阳性。3、脱色是革兰氏染色是否成功的关键，脱色不够造成假阳性，脱色过度造成假阴性。五、实验结果与讨论1.结果（1）绘出油镜下观察的混合区菌体图像。（2）填写表菌名菌体颜色细菌形态结果大肠杆菌金黄色葡头球菌2思考题(1)革兰氏染色是否成功，有哪些问题需要注意，为什么？(2)现有一株未知杆菌，个体明显大于大肠杆菌，请你鉴定该菌是革兰氏阳性还是革兰氏阴性，如何确定你的染色结果的正确性？(3)为什么用老龄菌进行革兰氏染色会造成假阳性？(4)你认为革兰氏染色法中哪个步骤可以省略？在何种情况下可以省略？(5)Gram在对死于肺炎的患者肺部组织进行检查时，经过染色，某些细菌（如肺炎球菌）保持蓝紫色，肺部组织背景为浅黄色，为什么肺部组织细胞未被染上蓝紫色？(6)脱色是革兰氏染色是否成功的关键，但是脱色时间的掌握对初学者来说有一定难度，因此有些初学者常制备多块图片来寻找适宜的脱色时间。如果老师要求你仅制备一块大肠杆菌和金黄色葡萄球菌混合涂片，并通过革兰氏染色法和油镜观察看到混合在一起的红色大肠杆菌和蓝紫色金黄色葡萄球菌，你用什么简单的方法来达到老师的要求？