干旱胁迫对小麦幼苗的影响

干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响杨万坤11412023811应用生物教育A班摘要：用小麦幼苗为实验材料，研究干旱胁迫对小麦幼苗生理生化指标的影响。试验结果表明：在干旱胁迫(5天)下小麦幼苗中脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、过氧化氢（H2O2）、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)、ASA的含量都较正常情况下小麦幼苗的含量高。关键字：干旱胁迫、小麦幼苗、Pro、MDA、H2O2、PPO、POD、GSH、ASA引言：小麦是我国北方地区的主要粮食作物，但是近几年北方地区旱情日益严重，小麦产量安全问题日益突出。干旱也属于逆境，水分在植物的生命活动中占主导地位，大多数植物遭受干旱逆境后各个生理过程都会受到不同程度的影响。干旱是我国农业可持续发展面临的主要问题之一,干旱胁迫对植物的影响是一个复杂的生理生化过程,涉及到许多生物大分子和小分子【1】。干旱胁迫对植物的影响主要体现在酶活性、膜系统、细胞失水等，导致细胞代谢紊乱，甚至是细胞死亡。本次试验测定正常生长的小麦幼苗和干旱胁迫处理小麦幼苗中脯氨酸（Pro）、丙二醛（MDA）、过氧化氢、抗氧化酶（PPO、POD）、谷胱甘肽(GSH)、ASA的含量变化,来研究干旱胁迫对小麦的影响，从而找到合适的方法来解决干旱胁迫问题，解决小麦生产安全问题提供理论依据。1材料与方法1.1材料及处理将小麦种子用0.1%HgCl2消毒10min后，用蒸馏水漂洗干净，用蒸馏水于26℃下吸涨12h，然后播于垫有6层湿润滤纸的带盖白磁盘（24cm×16cm）中→于26℃下暗萌发60h，计算发芽率（注意与前面结果比较），选取长势一致的小麦幼苗做干旱5天干旱处理。5天后用相同的方法分别对实验组和对照组的小麦进行脯氨酸、MDA、过氧化氢、抗氧化酶（PPO、POD）、GSH、ASA的含量的测定。1.2测定方法1.21玉米种子发芽率的测定各取50粒吸胀的玉米种子→沿胚的中心线切成两半（严格区分两个半粒），进行下列实验：其中50个半粒进行TTC染色（30℃水浴20min），另50个半粒进行曙红染色（室温染色10min）洗净后观察。根据两种方法的染色情况，分别计算发芽率。1.22小麦幼苗脯氨酸含量的测定分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3ml3%磺基水杨酸（SSA）和少许石英砂→充分研磨→用2ml3%SSA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。测定：上清液各2ml→分别加入2ml冰乙酸和2ml茚三酮试剂→煮沸15min→冷却后→5000rpm离心10min（若没沉淀可省略次步骤）→分别测定A520,将测得的结果用公式Procontent=用总显VVVWLA520（umol.g-1FW）计算出正常和干旱生长小麦的胚芽鞘的脯氨酸含量。1.23小麦幼苗MDA含量的测定分别取0.1g实验组和对照组→加入3ml10％TCA(和少许石英砂→充分研磨→用2ml10％TCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。测定：分别取上清液各2ml→加入0.6%TBA（用10%TCA配制）2ml→煮沸15min→冷却后→5000rpm离心10min→分别测定OD450和OD532将测得的D450和OD532的数据带入下列公式OD450=C1x85.4OD532=C1x7.4＋C2X155000求解方程得：C1/(mmol/L)=11.71OD450C2/(umol/L)=6.45OD532—0.56OD450计算出C1可溶性糖的浓度，C2为MDA的浓度。1.24小麦幼苗H2O2测定分别取0.51g实验组和对照组→加入3ml0.3%TCA和少许石英砂→充分研磨→用2ml0.3%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。测定：分别取上清液各4ml→加入0.1%Ti(SO4)2[用20%(v/v)H2SO4配制]1ml→摇匀→5000rpm离心10min→OD410将测得的OD410值带入下列公式H2O2content=用总显VVVWLA410（umol.g-1FW）计算出H2O2酶的含量。1.25小麦幼苗抗氧化酶的测定1、分别取0.1g实验材料→加入少许石英砂和3ml提取液（50mmol/LPBS,pH6.0,内含0.1mmol/LEDTA,1%PVP）→充分研磨→转入离心管中→用2ml提取液洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积→用于测定POD和PPO酶活性或分装后转至-20或-80℃保存。2、POD测定：取POD反应混合液（10mmol/L愈创木酚，5mmol/LH2O2,用PBS溶解）2.95ml，加入酶液50ul（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，每过1min记录一次在A470的读数值。3、PPO测定：取PPO反应混合液（20mmol/L邻苯二酚，用PBS溶解）2.9ml，加入酶液0.1ml（空白调零用PBS取代），立即记时，摇匀，每过30s记录一次在A410的读数值。以每分钟A值变化0.01所需要的酶液的量为一个活力单位（U），则：将测得的A470和A410数据带入公式PODactivities=用总显VVVtWA470（umol.g-1FW）的PPOactivies=用总VVtWA01.0410(U.g-1FW)计算出PPO和POD的值1.26小麦幼苗GSH的测定分别取0.1g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3ml5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2ml5%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。测定：上清液各1ml（空白用5%TCA代替）→分别加入2ml0.1MPBS(pH=7.7)→1ml2mMDTNB→25℃5min→测定A412将测得的A412值带入公式GSHcontent=用总显VVVWLA412(umol.g-1FW)将GSH的值计算出来1.27小麦幼苗ASA的测定•ASA的提取：分别取0.2g实验组和对照组的胚芽鞘→加入3ml5%三氯乙酸（TCA）和少许石英砂→充分研磨→用2ml5%TCA洗研钵→5000rpm离心10min→量上清液体积。•测定：上清液各0.8ml(空白用5%TCA代替)→分别加入0.8ml0.15MNaH2PO4(pH=7.4)和蒸馏水→摇匀→分别加入0.8ml5%TCA、44%磷酸和4%联吡啶→摇匀→加入3%FeCl30.8ml→37℃15min→测定A525•ASAcontent=用总显VVVWLA525(umol.g-1FW)2、结果与分析发芽率的测定：TTC染色法：44个具有活力。曙红染色法：44个具有活力。分别计算两种方法的发芽率：TTC法44/50×100%=88%；曙红染色法44/50×100%=88%。用两种方法测得的种子发芽率是一样的，都为88%,说明这一批种子的生命活力较高。脯氨酸含量测定：组别A520V总V显V用Procontent干旱组1.8424.8ml6ml2ml0.08187mol.g-1FW对照组0.0185.3ml6ml2ml0.00088mol.g-1FW计算结果为干旱组脯氨酸含量为0.08187mol.g-1FW，对照组脯氨酸含量为0.00088mol.g-1FW.实验组与对照组比较，可以看出实验组的脯氨酸含量是对照组的93倍。MDA含量的测定：数据组别OD532OD450结果C1C2干旱组0.3031.36716.007mmol/L1.189mol/L对照组0.0290.0380.445mmol/L0.166mol/L由上表可知干旱组的MDA的浓度为1.189mol/L，对照组的MDA的浓度为0.166mol/L，干旱组为对照组的7倍左右，说明当遇到干旱胁迫时小麦幼苗中MDA含量比正常生长的含量高。H2O2测定：组别V总V用V显OD410H2O2content干旱组3.8ml3.8ml4ml0.9800.14mol.g-1FW对照组4.7ml4ml4.2ml0.2020.0356mol.g-1FWProcontent00.020.040.060.080.1干旱组对照组Procontent(umol.g-1FW)丙二醛（C2）00.20.40.60.811.21.4干旱组对照组丙二醛umol/L）上述计算结果得到干旱组中H2O2为0.14umol.g-1FW，对照组中H2O2为0.0356umol.g-1FW，干旱组为对照组的4倍左右，说明当遇到干旱胁迫时小麦幼苗中H2O2含量迅速成倍上升。抗氧化酶的测定V总V用V显POD干旱组4.6ml0.05ml3ml对照组4.6ml0.05ml3mlPPO干旱组4.6ml0.1ml3ml对照组4.6ml0.1ml3mlPOD在不同时间的A470值：时间和结果组别1min2min3min4minPODactivities（t=4min）干旱组1.221.611.862.5650.0456umol.g-1FWmin-1对照组1.031.5281.7892.2020.0342umol.g-1FWmin-1PPO在不同时间的A410值：时间和结果组别0.5min1min1.5min2minPPOactivities(t=2min)干旱组0.0410.0820.1180.1473250.7U.g-1FW对照组0.0420.0820.1090.1322790.7U.g-1FWH2O2content00.020.040.060.080.10.120.140.16干旱组对照组H2O2测定(mol.g-1FW)PODactivities（t=4min）00.010.020.030.040.05干旱组对照组PODactivities（umol.g-1FWmin-1）PPOactivities(t=2min)250026002700280029003000310032003300干旱组对照组PPOactivities(U.g-1FW)由上表可知当小麦幼苗遭受干旱胁迫时，抗氧化酶（POD,PPO）含量有明显上升。GSH的测定组别V总V用V显A412GSHcontent干旱组4.3ml1ml4ml0.2070.0026umol.g-1FW对照组4.3ml1ml4ml0.0240.00031umol.g-1FW由上述计算结果可知受到干旱胁迫的小麦幼苗的胚芽鞘中GSH含量是正常生长的8倍左右，表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中GSH含量迅速上升。ASA的测定组别V总V显V用WA525ASAcontent干旱组4.4ml5.6ml0.8ml0.2g0.1060.00098umol.g-1FW对照组5.2ml5.6ml0.8ml0.2g0.0240.00026umol.g-1FW由上述计算结果可知受到干旱胁迫的小麦幼苗中ASA的含量是正常生长的4倍左右，表明遭受干旱胁迫时小麦幼苗中ASA含量迅速上升。3、讨论测定玉米发芽率时所用的两种方法：TTC染色法和曙红染色法测得发芽率均为88%。TTC染色法的染色部位是胚，染色较深，能清晰判别胚的死活，曙红ASAcontent00.00020.00040.00060.00080.0010.0012干旱组对照组ASAcontent(umol.g-1FW)GSHcontent00.00050.0010.00150.0020.00250.003干旱组对照组GSHcontent(umol.g-1FW)染色法的染色部位是胚乳，着色较浅。实验中玉米用两种方法都发现有部分玉米胚细胞坏死，但主要在子叶部分，少许在胚根处（判断为不能正常发芽生长），这批玉米种子可能因为储存时间过长或其他因素造成影响，影响其发芽率，但总体来说这批种子发芽率很高。本次实验结果中当小麦幼苗遭受干旱胁迫时，脯氨酸含量增高，其中脯氨酸含量是正常生长小麦幼苗的93倍，这一结果与洪法水、李樊和在研究自然干旱胁迫下小麦品种游离脯氨酸与抗旱性的关系所得到的结果基本相似【2】。科学研究发现：脯氨酸是水溶性最大的氨基酸，具有很强的水合能力，其水溶液具有很高的水势。脯氨酸的疏水端可与蛋白质结合，亲