地高辛标记探针的Southern杂交技术

地高辛标记探针的Southern杂交技术根据核酸变性与复性的特性，特定核苷酸序列的单链DNA或RNA能够在一定条件下与具有互补性的核酸链退火形成双链结构，称之为核酸杂交。将已知的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA进行标记，制成核酸探针，就可以用它检测样品中是否存在同源序列，或确定不同物种之间的亲缘关系，已成为分子生物学中一类重要的检测手段，在科学研究和实践中具有十分广泛的用途。它可用于基因组特定DNA序列的定位，测定相关片段的同源性、从cDNA文库、基因组文库中筛选完整基因等。还可以用于构建DNA分子的酶切图谱和遗传图—指纹分析等。核酸杂交检测都是在滤膜上进行的，常用的滤膜有尼龙滤膜、硝酸纤维素滤膜等。其基本过程包括以下几步。首先将待检样品DNA或RNA分子直接点加到滤膜上，或经过凝胶电泳分离再通过毛细管作用或电导作用被转移到滤膜上，而且是按其在凝胶中的位置原封不动地“吸印”上去的，这个过程称为核酸印迹（nucleicacidblotting）转移，主要有电泳凝胶核酸印迹法、斑点和狭线印迹法（dotandslotblotting）、菌落和嗜菌斑印迹法（colonyandplaqueblotting）；然后将具有核酸印迹的滤膜同带有放射性标记或其它标记的DNA或RNA探针进行杂交。最后，经过放射自显影技术或光化学、免疫学技术显示出不同的颜色，根据颜色的有无和深浅判定结果。根据操作方式和检测对象的不同，核酸杂交技术主要有以下几种：斑点杂交技术（Dotblot）、Southern杂交技术（Southernblot）、Northern杂交技术（Northernblot）。前两者用于检测DNA，后者用于检测RNA。本实验主要介绍Southern杂交技术。1主要内容1.SouthernBlot方法的原理。2.DNA琼脂糖凝胶电泳。3.DNA转移至硝酸纤维素膜/尼龙膜及膜处理。4.介绍随机引物法标记DNA探针，Southernblot的预杂交、杂交及显色过程。2目的要求掌握Southernblot方法的原理；掌握随机引物法标记DNA探针，印迹法转移DNA至硝酸纤维素膜及膜处理。3实验原理Southern杂交技术是由EdwardM.Southern在1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交技术，并因此而得名。Southern杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性内切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。见图1。图1.Southernblot印迹杂交原理示意图（a）核酸内切酶消化的基因组DNA；（b）琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段；（c）凝胶中的DNA谱带转移到硝酸纤维素滤膜上；（d）滤膜与标记的DNA分子探针杂交；（e）显色显示杂交的DNA谱带。Southernblot方法十分灵敏，在理想的条件下，用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2ngDNA也能被清晰地检测出来。一、实验仪器：尼龙膜；恒温水浴，塑料带，剪刀，平头镊子，封口机，烤箱，台式高速离心机，高压灭菌锅，电泳仪，水平电泳槽，微量移液器，摇床，吸水纸，3MMWhatman滤纸，干烤皿，玻璃平台等。二、溶液配制1．待检基因组DNA、DIG标记和检测试剂盒、各种限制性内切酶等。2．其他试剂(1)20XSSC(1000mL):组分浓度3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠NaCl175.32g柠檬酸钠88.26gNaOH调pH值到7.0，(2)洗涤缓冲液Washingbuffer200ml组分浓度：0.1MMaleicacid,0.15MNacl;pH7.5(20℃);0.3%(v/v)Tween20.马来酸：2.32gNacl：1.75gTween200.6mlNaOH固体约1.7g调pH值7.5(3)马来酸缓冲液Maleicacidbuffer200ml组分浓度：0.1MMaleicacid,0.15MNacl;pH7.5(20ºC)马来酸：2.32gNacl：1.75gTween200.6mlNaOH固体约1.7g调pH值7.5(4)检测缓冲液Detectionbuffer100ml组分浓度：0.1MTris-HCl,0.1MNacl,pH9.5(20ºC)Tris1.21g,NaCl0.584gMgCl21.01g调ph值到9.5(5)变性溶液(500mL)：1mol/LNaCl(43.83g)，0.5mol/LNaOH(10g)，(6)中和溶液(500mL)：0.5mol/LTris(30.27g)，3mol/LNaCl(87.66g)，用1mol/LHCl调(7)5×TBE(250mL)：13.5gTris6.9g硼酸,0.9gEDTA-Na2，定容250mL(8)6×溴酚蓝载样液：0.25％溴酚蓝，40％蔗糖(9)1MTris-HCl(pH8.0):称取12.114gTris-base,溶于80ml蒸馏水中，用HCl调pH至8.0后，用蒸馏水定容至100ml，高压灭菌，分装保存。(10)0.5MEDTA(pH8.0):称取18.61gEDTA，溶于80ml蒸馏水中，用NaOH调pH至8.0后，用蒸馏水定容至100ml，高压灭菌，分装保存。(11)TEbuffer：取1MTris-HCl(pH8.0)5ml，0.5MEDTA(pH8.0)1ml，用蒸馏水定容至500ml，调pH至8.0后，高压灭菌，分装保存。(12)10%SDS：称取10gSDS，溶于90ml蒸馏水中，68℃加热溶解，用盐酸调pH至7.2，定容至100ml。(13)低严谨度洗膜液：将20X的SSC用蒸馏水稀释成2XSSC，并按照100:1(2XSSC:10%SDS)加入10%SDS，配成2XSSC0.1%SDS。(14)高严谨度洗膜液：将20X的SSC用蒸馏水稀释成0.5XSSC，并按照100:1(0.5XSSC:10%SDS)加入10%SDS，配成0.5XSSC0.1%SDS。(15)BlockingSolution:用Maleicacidbuffer将6#中的10XBlockingSolution稀释成1X的工作液，现配现用。(16)AntibodySolution:将4#试剂离心，按照1:5000加入BlockingSolution，2-8℃可保存12小时，即每5mlBlockingSolution中加1ulAb抗体，与地高辛标记探针结合。(17)Colorsubstratesolution(显色液)：将5#试剂按照1:50用Detectionbuffer稀释，即从5#中取100ul加入5mlDetectionbuffer，要避光，现配现用，用于显示抗体结合位点。(18)杂交液DiGEasyHyb：将64ml无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37ºC摇动溶解5min。三、基因组DNA的提取、酶切与电泳分离(1)酶切反应体系DNA1μg/μl15μg10×酶切buffer5μl限制性内切酶（10U/μl）6μl加ddH2O至50μl(2)混匀后于37ºC酶切1-3h，酶切完成后，取3μl酶切反应物电泳分析，检测酶切效果(3)酶切完成后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。四、琼脂糖凝胶电泳(1)用0.5×TBE配制0.8%的琼脂糖凝胶，凝胶厚度约为0.5cm。(2)待凝胶充分凝固后，在点样孔中依次加入：阳性对照：质粒酶切产物，阴性对照：水及检测样品。(3)加入电泳缓冲液至刚好与胶面持平，加100V电压，电泳5min待溴酚蓝进入胶中后，将电压降至80V电泳30min，(4)电泳结束后，染色，长波紫外线下观察电泳结果，用1张保鲜膜覆盖在凝胶上，复制下各分子量参照物及各DNA样品带的位置，在凝胶旁置1标尺照像五、变性与转膜(1)将胶浸于4倍体积的变性溶液中，在摇床上温和摇动2×15min，变性液要能没过胶。(2)将胶在双蒸水中稍微洗涤，然后放入4倍体积的中和溶液中，在摇床上温和摇动2×15min，中和液要能没过胶。(3)转膜：20×SSC浸湿一张whatman3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个“桥”，凝胶反放在浸湿的whatman3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。(4)照凝胶的大小剪一张硝酸纤维素滤膜/尼龙膜（长，宽略大0.2cm，剪去与凝胶对应的一角）。膜放在凝胶上。(5)尼龙膜上放一张whatman3mm滤纸（长，宽略小0.2cm）一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。在20×SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。(6)固定：将膜在2×SSC溶液中短暂漂洗，除去过多的盐分，然后DNA结合面朝上，放在一张干净的滤纸上晾干后，夹在两层滤纸中间，120ºC烘箱中30min，或者80ºC2h，促进DNA与硝酸纤维素滤膜/尼龙膜结合。六、预杂交与杂交(1)预杂交DiGEasyHyb：将64ml无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37ºC摇动溶解5min，预热一定体积的DiGEasyHyb（10ml/100cm2膜）至杂交温度42ºC。预杂交60min，在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42ºC下充分润湿。（此过程可以延长至数小时）(2)探针变性：Dig标记的探针1ul（约25ng/ml）加40µlH2O,95ºC变性10min后迅速放在冰上冷却10min。(3)杂交：将变性的探针加入预热的DIGEasyHyb（3.5ml/100cm2）中，混匀，避免泡沫，倒出预杂交液，加入探针和DIGEasyHyb混合液，继续在42ºC下温浴过夜（单拷贝探针）。含有探针的DiGEasyHyb杂交液可重复利用，杂交结束后放入离心管中于-20ºC保存，可重复使用几次，只需在使用前于68ºC处理10min即可,不要煮沸DiGEasyHyb杂交液七、洗膜与显色(1)洗膜：2×SSC，0.1%SDS室温下洗涤5分钟，洗2次。0.5×SSC，0.1%SDS65-68ºC温和振荡15分钟，洗2次(2)免疫与显色：a.杂交和洗膜后，用马来酸缓冲液（WashingBuffer，Buffer1）浸泡1-5minb.在100ml1×Blocksolution（Buffer2）中温育30minc.用1×Blocksolution（Buffer2）稀释抗体–DIG-抗原偶联物至150mU/ml（1:5000）d.用10mlantibodysolution处理膜30mine.用100ml马来酸洗膜15min，洗2次f.在20mldetectionbuffer（Buffer3）中平衡2-5ming.在8ml新鲜配制的colorsubstratesolution中处理膜5分钟，放在塑料袋或盒中，保持黑暗中。注意不要在显色过程中摇动(颜色沉淀在几分钟内开始出现，在16h内完成显色反应(在显色过程中膜可在光亮处短暂暴露几次)。h.5h后斑点出现，可在20ml水中洗膜5min中止反应。i.结果照像注意事项1.膜的大小及预杂交、杂交过程中所用试剂的量可根据需要进行适当调整。2．将凝胶中和至中性时，要测pH，防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维素膜。3.要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜/尼龙膜之间的气泡。思考题1．什么是印迹技术？2．说明什么是探针？3．简述Southernblot技术的原理及应用。