培养细胞的观察和检测方法.

培养细胞的观察检测方法生物技术教研室李延兰活细胞的观察检测方法培养细胞常用的染色方法细胞生长状况有关指标的检测方法细胞生物活性的有关化学检测方法电子显微镜技术一、活细胞的观察检测方法肉眼观察相差显微镜观察细胞在体外培养过程中需要每天观察，以便及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄、是否更换等。细胞常规检查的方法为：肉眼观察一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。pH颜色透明度正常7.2～7.4桃红色清亮、透明酸性产物↓↓变浅、变黄污染混浊变黄←pH↓↓pH↑↑→变红大多数细胞适于在pH7.2～7.4条件下生长，低于pH6.8或高于pH7.6对细胞有害，甚至造成细胞退化或死亡。细胞对碱性不如对酸性的变化耐受，偏酸的条件比偏碱的环境对细胞生长有利。随细胞数量的增多、代谢加强，释放CO2增多，使pH降低。为了维持培养基恒定的pH，多在培养基中加入磷酸盐等缓冲剂。羟乙基哌嗪乙硫磺酸（Hepes）：对细胞无毒性，也不起缓冲作用，主要作用是防止pH迅速变动，在开瓶通气培养或活细胞观察时能维持较恒定的pH值。若培养瓶、瓶塞漏气，使CO2溢出，或者由于洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，致使细胞难以生长，甚至死亡。玻璃器材常用的玻璃器材有各种规格的玻璃瓶、培养瓶、培养皿、吸管、离心管。首次使用：重复使用的处理步骤：自来水刷洗0.1％稀盐酸浸泡过夜自来水冲洗自来水刷洗硫酸－重铬酸钾浸泡过夜自来水冲洗10次双蒸水冲洗2次单蒸水冲洗3次晾干、包装121℃高压蒸汽灭菌20min显微镜观察相差显微镜（phasecontrastmicroscope）活细胞对光线是透明的，光线通过活细胞时，波长和振幅几乎没有改变，所以用普通光镜无法看清未经染色的活细胞。20世纪30年代荷兰Zernike原理：利用光的衍射和干涉特性，把透过标本不同区域的光波的光程差转变成振幅差，使细胞内各种结构之间呈现清晰可见的明暗对比，从而使标本的各种结构变得清晰。相差显微镜观察活细胞的步骤如下：调整好相差显微镜观察瓶皿准备调光调焦与摄影细胞观察生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。细胞的生长状态BMSCs培养细胞的生长过程各种细胞及各代细胞增殖的时间不尽相同。原代细胞、成体组织的潜伏期较长，24h后仅见到部分细胞开始贴壁，9～12d长满瓶底，细胞融合呈交叉重叠生长。传代细胞系、胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期、对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底80％就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。Anip973注意事项标准化生产的培养板、培养瓶或皿一般成像效果都较好，但反复刷洗过的玻璃或塑料器皿将严重影响分辨力。准备观察的瓶、皿要平坦，质地均匀，透光度好，在观察前将培养瓶、皿面擦净。天气较冷时，由于温差使培养瓶内壁形成雾滴而影响观察的清晰度，可轻轻将瓶倾斜使瓶内培养液浸润内壁，以得到好的相差像。对原代细胞培养进行相差显微照相，应在换液后进行，这样可以去除漂浮的组织块和死细胞，提高成像清晰度。观察细胞时要有无菌概念，动作要轻，避免猛烈震荡；观察时间不要太长，观察次数也不要太频繁，以免影响细胞生长。活细胞的观察检测方法暗视野显微镜技术观察活细胞缩时显微镜摄影观察体外活细胞染色观察暗视野显微镜技术观察活细胞（darkfieldmicroscope)原理：利用特殊聚光器使光线不能进入物镜，经过标本的散射光线使物镜被放大，因此在黑暗背景中可呈现明亮的像。优点：反差增大，分辨率提高，可观察到5nm的微小质点。应用：观察活细胞内的细胞核、线粒体、细菌和霉菌等。缩时显微摄影术观察（time-lapsecinemicrophotagraphy，TLCM）优点：可直接记录活细胞的连续动态变化过程，能非常直观地展现细胞生长过程中的动态变化，如细胞运动、细胞分裂、细胞膜变化、细胞死亡等过程。缺点：较昂贵体外活细胞染色观察体外活细胞染色就是在体外培养条件下，用某种染料对活细胞进行染色，而不影响活细胞生命活动的一种方法。利用这种方法，可以对培养物进行染色观察，经染色的培养物还可以继续进行培养。碱性染料酸性染料（台盼蓝、刚果红、吡咯蓝）活体染料噻嗪类（次甲基蓝、甲苯胺蓝）恶嗪类（亮焦油蓝、亮焦油紫）丫嗪类（中性红、詹纳斯绿）三酚苯甲烷类（甲基紫、维克多利亚蓝）中性红染色常用活体染料，一般浓度为1：10000，用生理盐水（或Hanks液）溶解后进行高压蒸汽灭菌暗处存放，可直接浸染活体细胞显微镜下观察或用于细胞的病毒蚀斑，肉眼计数空斑数目。因其毒性大，染色后细胞不能再培养。结晶紫染色使用浓度为0.1％，可用生理盐水配制，室温保存。该染料对死、活细胞均着色，故只能测出细胞总数。台盼蓝染色用0.5％浓度的台盼蓝（trypanblue)，用PBS配制，室温保存，该染料只对死细胞着色，可测定活细胞数和计算存活百分率。E.coli以结晶紫(crystalviolet)染色B.cereus以石炭酸复红(carbolfuchsin)染色aureus以甲烯蓝(methyleneblue)染色二、培养细胞常用的染色方法细胞固定的基本方法细胞常用的染色方法细胞特殊的染色方法1、细胞固定的基本方法固定组织、细胞的目的：把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等；同时，固定还可以使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。固定组织、细胞的原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。固定前的准备：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。悬浮细胞：离心（800～1000r/min）→PBS/Hanks漂洗2～3次贴壁细胞：用镊子轻轻取出盖片→PBS/Hanks漂洗2～3次注：漂洗的目的是去除血清和附着于细胞表面的残渣，防止其妨碍染色。常用固定液简单固定液：甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、戊二醛、苦味酸、重铬酸钾、锇酸等混合固定液：甲醇/醋酸固定液、FAA固定液、Carnoy固定液、Bouin固定液、4％多聚甲醛-PBS固定液等甲醇/醋酸固定液：甲醇：冰醋酸为3：1，现用现配，适用于Giemsa染色。FAA固定液：90mL80％酒精＋5mL冰乙酸＋5mL40％甲醛，适用于盖片单层培养的细胞，固定效果好。Carnoy固定液：较好的非水溶性固定液，60mL纯酒精＋30mL氯仿＋10mL冰乙酸，适用于显示细胞化学成分。2、细胞常用的染色方法H.E（苏木精-伊红）染色法原理：碱性染料苏木精和酸性染料伊红分别与细胞核和细胞质发生反应，使细胞的微细结构通过颜色而改变它的折射率，从而在光镜下能清晰地呈现出细胞的图像，并能提供良好的核浆对比染色。染液配制：染色步骤：染色结果：细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。Giemsa（吉姆萨）染色法母液配制：Giemsa粉0.5g，甘油22mL，将Giemsa粉置于研钵内先用少量甘油与之充分混合，研磨至无颗粒；然后将剩余甘油混在一起，56℃保温2h后，加入33mL纯甲醇，混匀，即为Giemsa母液，保存于棕色瓶内。染液配制：取9份pH6.8~7.38的Sorensen缓冲液和1份Giemsa母液混合即可。染色步骤：细胞标本用甲醇/醋酸固定液固定30min后，用滴管把染液布满玻片上，染色10~15min，用自来水冲去多余染液，空气干燥，二甲苯同名，光学树脂封固。染色结果：细胞核染成红色，细胞质染成蓝色。注意事项：染液宜现配现用，保存时间最好不用超过48h，Giemsa对pH极敏感，缓冲液pH要调准确。3、细胞特殊的染色方法Feulgen染色法Coomassie染色法PAS反应法油红O（oilredO）法免疫荧光染色法免疫酶染色法Feulgen（福尔根）染色法原理：在60℃条件下，DNA分子中的嘌呤碱和脱氧核糖的连键可被1mol/L盐酸水解打开，游离出的脱氧核糖醛基能与希夫（Schiff）试剂结合，形成紫红色复合物。在此过程中，RNA不受影响，故染色具DNA特异性。准确的温度和盐酸浓度，适宜的水温、时间是成功的关键。水温过度或不足均降低染色强度。此法能对DNA进行特异性染色试剂配制：1mol/LHCL：浓HCL8.5ml＋蒸馏水91.5mlSchiff试剂：母液装入棕色瓶，盖紧，黑纸包裹置于暗处染色过程：选用Carnoy固定液染色结果：细胞核染成粉红色至紫红色，胞质为无色。考马斯亮蓝（Coomassie，BB）染色法原理：显示细胞骨架、细胞内微丝的染色方法试剂配制：固定液：0.1mol/LNaH2PO4·2H2O14.0mL＋0.1mol/LNa2HPO4·12H2O36.0mL＋蒸馏水50.9mL＋25％戊二醛50.0mL染色液：甲醇46.5mL＋冰醋酸7.0mL＋考马斯亮蓝0.02g染色过程：染色结构：细胞内的微丝呈现蓝色。过碘酸席夫反应法（periodicacidSchiffreaction，PAS）原理：过碘酸是一种强氧化剂，能将葡萄糖的乙二醇基（CHOH-CHOH）氧化成两个游离的醛基，它们与Schiff试剂反应生成紫红色产物。细胞内糖类的染色方法试剂配制：染色过程：染色结果：细胞含糖原区呈紫红色。细胞内脂类的染色方法苏丹（Sudan）Ⅲ/Ⅳ法苏丹黑法Lillie油红O（oilredO）法Cain硫酸尼罗蓝（Nile）法锇酸（osmicacid）法油红O（oilredO）法优点：油红O染色的脂肪比苏丹Ⅲ法染的颜色要深，对微小的脂滴易于显示，而且沉淀较少。10％中性甲醛溶液的配制﹙pH7.0﹚：量取37％~40％甲醛20mL，蒸馏水180mL，加入0.8g磷酸二氢钠﹙NaH2PO4·H2O﹚、1.3g磷酸氢二钠﹙Na2HPO4﹚，配制成200mL10％中性甲醛溶液，密封备用。免疫荧光染色法原理：将已知抗体或抗原标记荧光素，用此特异性试剂，浸染含有相应抗原或抗体的组织细胞标本，借助抗原抗体的特异性结合，于抗原或抗体的存在部位呈现荧光，从而可以定位标本内的抗原或抗体。免疫酶染色法原理：ABC免疫酶染色法即卵白素-生物素-酶复合物法，是目前最敏感的免疫细胞化学染色法之一。其基本原理是将特异性第一抗体与组织细胞相应抗原结合后，通过生物素化桥抗体与第一抗体结合，借助卵白素与生物素的天然亲和性将生物素化辣根过氧化酶连接为复合物，通过酶促反应，显示组织细胞相应的抗原。三、细胞生长状况有关指标的检测方法细胞计数法细胞生长曲线细胞分裂指数克隆形成率1、细胞计数法细胞计数法是用血细胞计数板计数细胞悬液中的细胞数目，以测定细胞增殖和调整细胞浓度。台盼蓝染色法用于检测存活细胞数。注：台盼蓝染色——排除检测法，由于死细胞的细胞膜通透性发生改变，染料可大量进入却不能被排出，因而细胞被染色；而活细胞能排出细胞内的染料，因而不易着色。Trypanbluestainingofadultratcardiacmyocytesinprimaryculture.Livecellsexcludethebluedye,andsoappearclear.Deadcellstakeupthedyeandappearblue.结果分析细胞密度细胞数/ml＝（4大格细胞数之和/4）×104×稀释倍数细胞存活百分率细胞活力（％）＝未着色细胞数÷总细胞数×100％2、细胞生长曲线细胞生长曲线是细胞培养实验中最基本的指标，是观察同一代细胞的增殖过程。根据细胞生长曲线分析细胞增殖方法一：在同一规格的培养瓶中，接种同等量