基因工程制药复习提纲答案

名词解释1.基因工程基因工程是值在体外合成或重组特定的DNA，再与载体连接，最后导入到宿主细胞内表达、扩增出人们需要的蛋白质，而且使这种性状可遗传给后代的技术。包括上游技术和下游技术。2.基因工程制药基因工程制药是通过基因工程的方法生产药物，具体包括获得目的基因、构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、产物分离纯化、产品加工检验等步骤。3.逆转录逆转录（reversetranscription）是某些RNA病毒由逆转录酶直接利用RNA为模板合成DNA的过程。4.CDNA以生物细胞的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，然后在合成双链DNA，并将合成的cDNA双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，倒入宿主细胞进行增殖。在这个过程中合成的双链DNA叫做cDNA。5.引物引物是人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5’端相同。是PCR的起始点。6.表达载体所谓表达载体（expressionvector）是指具有宿主细胞基因表达所需的调节控制序列，能使外源基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。7.克隆载体克隆载体（cloningvector)是把一个有用的制药DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中进行繁殖的工具。8.载体载体（vector），指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。9.报告基因载体分子上有一种特殊意义的基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经进入宿主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来。这种基因就是报告基因。10.启动子启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能被RNA聚合酶识别并结合，具有转录起始的特异性11.PCR聚合酶链式反应是一种体外放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它主要包括变性、退火、延伸三个过程，并且多次循环。12.包涵体包涵体（inclusionbody）是存在于细胞质中的一种不可溶的蛋白质聚集折叠而形成的晶体结构物。通常包涵体虽然具有正确的氨基酸序列，但是空间结构却是错误的。13.蛋白表达系统蛋白表达系统是指由宿主、外源基因、载体和辅助成分组成的体系，通过这个体系实现外源基因在宿主细胞中表达的目的。14.单克隆抗体由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。15.基因工程抗体基因工程抗体就是按不同的目的和需求，对抗体基因进行加工、改造和重新装配，然后导入适当的受体细胞中表达得到的抗体分子。16.改形抗体改性抗体（reshapedantibody,RAb）是指利用基因工程技术，将人抗体可变区（V）中互补决定簇序列改换成鼠源单抗互补决定簇。重构成既具有鼠源性单抗的特异性又保持抗体亲和力的人源化抗体。17.嵌合抗体在基因水平上将鼠源单克隆抗体可变区和人抗体恒定区连接起来并在合适的宿主细胞中表达，这种抗体叫做嵌合抗体（chimericantibody）。18.镶面抗体将鼠源单抗可变区中氨基酸残基改造成人源的，消除了异源性且不影响可变区的整体空间构象。19.单链抗体单链抗体(singlechainantibodyfragment，scFv)，是由抗体重链可变区和轻链可变区通过15～20个氨基酸的短肽(linker)连接而成。scFv能较好地保留其对抗原的亲和活性,并具有分子量小、穿透力强和抗原性弱等特点。20.双特异性抗体双特异性抗体（bispecificantibody,BsAb)是指具有两种抗原结合特性的抗体21.展示技术是在基因或突变体文库中选择有用的基因或突变体的一种高通量的筛选方法，该技术的特点是利用筛选基因的表型和基因型密切相连的特性，通过筛选表型而获得基因型22.重组蛋白药物的复制对专利期满的重组蛋白药物进行复制生产23.易错PCR易错PCR是指通过改变PCR反应条件来调整PCR反应中的突变频率，降低聚合酶固有的突变序列的倾向性，提高突变谱的多样性，使得错误碱基随机地以一定的频率掺入到扩增的基因中，从而得到随机突变的DNA群体，最后用合适的载体克隆突变基因。24.Gene改组DNA改组是指DNA分子的体外重组，是基因在分子水平上进行有性重组(sexualrecombination)。通过改变单个基因(或基因家族，genefamily)原有的核苷酸序列，创造新基因，并赋予表达产物以新功能。25.盒式诱变是一种定点突变技术，将目的基因的一段DNA删掉，并用人工化学合成所具有的突变核苷酸的双链寡核苷酸片段取代，产生相应的突变体。26.大引物诱变法一种简单的PCR定点诱变法，是以第一轮PCR扩增产物作为第二轮PCR扩增的大引物，只需三种扩增引物进行两轮PCR反应，即可获得突变体DNA27.基因工程疫苗使用DNA重组生物技术，把天然的或人工合成的遗传物质定向插入细菌、酵母菌或哺乳动物细胞中，使之充分表达，经纯化后而制得的疫苗。28.新型疫苗新型疫苗是采用生物化学合成技术、人工变异技术、分子微生物学技术、基因工程技术等现代生物技术制造出的疫苗，是近年来新发展的疫苗。其有别于传统常规疫苗。包括基因工程亚单位疫苗、重组疫苗、合成肽疫苗、基因工程载体疫苗、核酸疫苗和抗独特型抗体疫苗等。29.灭活疫苗灭活疫苗是先对病毒或细菌培养，然后用加热或化学剂（通常是福尔马林）将其灭活使其失去致病力，但仍保留免疫原性而制成的生物制剂30.弱毒疫苗弱毒疫苗，是一种病原致病力减弱但仍具有活力的完整病原疫苗，也就是用人工致弱或自然筛选的弱毒株，经培养后制备的疫苗。31.合成多肽疫苗用化学手段合成病原微生物的保护性多肽活表位并将其连接到大分子载体上，再加入佐剂制成的疫苗。32.基因缺失疫苗用基因工程技术将病毒或细菌的致病性基因进行缺失，从而获得弱毒株活疫苗。33.亚单位疫苗指除去病原体中无免疫保护作用的有害成分，保留其有效的免疫原成分制成疫苗。34.重组活载体疫苗用基因工程技术将病毒或细菌构建成一个载体，把外源保护性抗原基因插入其中使之表达的活疫苗。35.反向遗传操作与经典的从表型改变到进行基因特征研究的思路相反，是指通过构建RNA病毒的感染性分子克隆，在病毒cDNA分子水平上对其进行体外人工操作36.基因疫苗基因疫苗指的是DNA疫苗，即将编码某种抗原蛋白的外源基因插入到含真核表达系统的质粒上，然后将质粒直接导入人或动物体内，让其在宿主细胞中表达合成抗原蛋白，诱导机体产生免疫应答。37.核酸疫苗核酸疫苗是将编码某种抗原蛋白的外源基因(DNA或RNA)直接导入动物体细胞内，并通过宿主细胞的表达系统合成抗原蛋白，诱导宿主产生对该抗原蛋白的免疫应答，以达到预防和治疗疾病的目的38.肿瘤疫苗是通过激活患者自身免疫系统，利用肿瘤细胞或肿瘤抗原物质诱导机体的特异性细胞免疫和体液免疫反应，增强机体的抗癌能力，阻止肿瘤的生长、扩散和复发，以达到清除或控制肿瘤的目的。39.避孕疫苗避孕疫苗是一种具有科学性、长期性及可逆性的避孕方法。世界各国都在从事这方面的研究工作。其基本原理是通过提取一种抗原成分制成疫苗，给予受试对象产生相应的免疫反应，从而阻止受孕。此法只处于实验和研究阶段，尚未进入临床试验。问答题、1．制药基因的获得方法有哪些制药基因获得的方法一般分为直接获得法和间接获得法。一般来说，所谓的直接获得法就是直接从基因组DNA中获得制药基因；而间接获得法要先获得mRNA、cDNA等，间接从基因组DNA中获得制药基因。但真核生物基因组不仅庞大，而且结构复杂，分离时还要尽可能排除内含子，所以常用间接法获得制药基因。具体方法常有两种：一是从cDNA文库克隆制药基因，首先以mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，然后再合成双链DNA，并将双链DNA重组到质粒载体或噬菌体载体上，导入大肠杆菌宿主细胞进行增殖；二是通过RT-PCR以mRNA逆转录得到的cDNA第一条链为模板，设计特定的引物，扩增获得制药基因产物。但是RT-PCR分离制药基因必须以制药基因的序列已知为前提。2．基因工程制药的内涵？基因工程制药是根据所需要的蛋白药物，3．什么是PCR?一般的PBL包括哪些步骤？PCR是聚合酶链式反应，聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction）技术是利用酶促反应在体外指导特定DNA序列扩增的方法，以热变性的双链DNA分子为模板，利用引物和四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）为原料在DNA聚合酶的作用下大量扩增了特定的DNA片段。一般的PCR包括以下几个过程：1.变性，DNA双链在高温下（一般为94℃）会解离成两条单链DNA分子。2.退火，降低反应温度（约50℃），使专门设计的一对寡核苷酸引物与两条单链模板DNA因发生退火作用而结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。3.延伸，将反应混合物的温度上升到72℃左右，此时在DNA聚合酶的作用下，引物的3端便开始依次参入脱氧核苷三磷酸分子，并沿着模板分子按照5——3方向延伸，合成新的DNA互补链。4．什么是引物？引物设计的原则有哪些？引物是人工合成的两端寡核苷酸序列，一个引物与目的基因一段的一条DNA模板链互补，另一个引物与目的基因的另一端的另一条DNA模板链互补。是PCR的起始点。1.引物长度在15-30bp之间，而且上下游引物长度差别不能大于3bp.2引物碱基的分布是随机的，理论上是分布均匀的。3.GC碱基含量在45%——55%左右。4.两个引物在3端必须与模板互补，在5端可以不互补。5.自身连续互补碱基小于4个6.引物之间连续互补碱基应小于4—5个7.3端末位碱基最好不选A5．基因工程载体的特性有哪些？1能够在宿主细胞内进行独立和稳定的自我复制，尽管有外源基因的插入，这种稳定复制状态和遗传特性不会改变。2易于从宿主细胞中分离、纯化。3具有较小的分子量和松弛型复制子。、4在载体DNA复制的非必需区内，存在有适当的限制性内切酶位点。5具有能够观察的表型特征。6．基因工程载体一般分为哪两类？分别适应于何种实验目的？基因工程载体一般分为克隆载体和表达载体。克隆载体是携带外源基因进入宿主细胞，使外源基因在宿主细胞中繁殖的载体。适用于扩增重组质粒但不要求表达蛋白。表达载体是适合在宿主细胞中表达外源基因的载体，它必须具有强启动子和终止子，能够高效的转录来自外源基因的mRNA。适用于下游技术中蛋白质的表达。7．cDNA的获得过程？cDNA是以生物细胞内的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，再经过RNAse酶的作用消化RNA链，再以得到的cDNA单链为模板合成双链cDNA。并将合成的cDNA双链重组到质粒载体或噬菌体载体中增殖。8．原核表达载体的基本元件有哪些？原核表达载体的基本元件有1启动子：启动子是指DNA链上一段能与RNA聚合酶结合并能启动mRNA合成的序列。2阻遏子：使启动子受到控制，只有当诱导时才能进行转录3SD序列：核糖体RNA识别结合位点4选择标记：载体中的表达标记用于转化后的菌体筛选。5转录终止子：在一个基因的3末端或是一个操纵子的3'末端往往有特定的核苷酸序列，且具有终止转录功能。9．外源蛋白的表达形式有哪些？1.以包涵体的形式表达外源蛋白，包涵体是存在于细胞质中一种不可溶的蛋白质聚集折叠形成的晶体结构物。2以外分泌形式表达的外源蛋白，分泌型蛋白是指将外源基因的表达产物运输到周质或细胞外的一种表达方式。3以融合蛋白的形式表达外源蛋白，融合蛋白是指由克隆在一起的两个或数个不同基因的编码序列组成的融合基因转译产生的单一多肽序列。10．蛋白表达系统有哪些？列表比较其优劣及适用范围P43,表2-3各种表达系统的比较11．原核系统表达系统有哪些优缺点？原核表达载体的邮电：遗传背景相对清楚、使用安全、易操作、表达量大、生产成本低、周期短，以及有大量可供选择的克隆或表达载体；主要缺点在于：①缺乏翻译后加工修饰系统，特别是缺少糖基化功能。②自身含有内毒素和毒蛋白，对纯化带来一定的难度。③蛋白不能正确折叠，复性较困难，多形成包涵体，提取步骤繁琐。12．植物表达系统的优缺点？经济实用，成本低，表达产