兽医生物制品(黄淑坚)

绪论一、生物制品与兽医生物制品1、生物制品：利用微生物及其代谢产物、寄生虫及其代谢产物、动物毒素→抗毒素、人或动物的组织、血液等经过加工处理制成用于人或动物相关疾病的诊断、预防、治疗的制剂。2、兽医生物制品：专用于动物相关疾病的诊断、预防、治疗的制剂。二、生物制品的发展史三、生物制品在生产中的应用1、诊断；2、预防；3治疗第一章常用兽医生物制品的种类（一）预防用兽医生物制品1、灭活苗（灭能苗）：利用物理或化学方法将病原微生物灭活使其丧失致病性和毒性加入佐剂制成；2、弱毒苗：利用物理、化学或微生物方法处理或传代微生物，使其失去致病性或仅造成隐性感染，大量繁殖后加入冻干保护剂制成；3、类毒素：细菌的外毒素经甲醛处理脱毒后免疫原性基本保持不变，加入佐剂制成（例：破伤风明矾沉降类毒素）；4、亚单位疫苗：通过物理、化学方法提取病原微生物表面保护性抗原，加入佐剂制成；5、合成肽疫苗：根据病原性微生物表面保护性Ag的氨基酸排列顺序，体外合成后加入佐剂制成；6、抗独特型抗体疫苗：根据免疫网络学说原理，利用第一抗体分子中的独特抗原决定簇（抗原表位）所制备的具有抗原的“内影像”结构的第二抗体。该抗体具有模拟抗原的特性，故称之为抗独特型疫苗；7、基因工程苗：包括基因缺失苗（伪狂犬基因缺失苗）、基因表达疫苗；8、多联苗：利用多种微生物制成疫苗；9、多价苗：利用一种微生物多种血清型（或者血清亚型）制成疫苗；10、同源疫苗：一种微生物制成疫苗免疫动物后，用于预防该微生物强毒的感染与攻击，这种疫苗称为同源疫苗；11、异源疫苗：①用不同种微生物的菌（毒）株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对疫苗中并未含有的病原体产生抵抗力；②用同一种中一种型（生物型或动物源型）微生物的菌（毒）株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对异型病原体的抵抗力。例：NDIV→PEG流行性腹泻;HTV→MDV鸡马立克病毒；猪瘟兔化弱毒苗→牛病毒性腹泻；表1-1灭活疫苗与弱毒疫苗的比较种类优点缺点灭活疫苗比较安全，一般不发生全身性副作用，无返祖现象；有利于制备多价、多联等混合疫苗；制品稳定，受外界条件影响小，有利于运输、保存接种次数多、剂量大，免疫途径必须注射，不产生局部免疫；需要高浓度抗原物质，生产成本高。弱毒疫苗通常一次免疫即可成功，可采取多种感染途径（注射、滴鼻、饮水、喷雾、划痕）等。引起整个免疫应答，产生广谱性免疫及局部和全身性抗体。免疫力持久，有利于清除局部野毒；产量高，生产成本低。接种次数多、剂量大，免疫途径必须注射，不产生局部免疫；需要高浓度抗原物质，生产成本高。备注：FMDV口蹄疫、SFV猪瘟用乙烯亚胺类衍生物（结晶紫）制灭活苗其它细菌大都用0.3％甲醛灭活病毒0.5％甲醛灭活毒素0.4～0.7％甲醛灭活大多数细菌置于37℃培养灭活佐剂的运用：1、油乳佐剂（病毒疫苗）；2、Al(OH)3胶（细菌疫苗）；3、蜂胶（细菌）灭活剂：1、甲醛；2、结晶紫（猪瘟）；3、乙烯亚胺类衍生物（二）治疗用兽医生物制品1、抗病血清：Ag3~5次→动物→产生Ab，Ab主要存在于血液的血清中→提取血清→加入抗菌药物、防霉剂2、抗毒素：类毒素3~5次→动物→产生Ab→提取血清→加入抗菌药物、防霉剂3、高免卵黄液：Ag3~5次→母禽→产生Ab→移行至母禽产下蛋的蛋黄中→提取蛋黄→加入1～2倍生理盐水（含有抗菌药物、防霉剂）（三）诊断用兽医生物制品1、标准Ag2、标准Ab第二章兽医生物制品的发展趋势1、GMP（生产与管理）2、从第一代疫苗（灭、弱、亚、类）→第二代疫苗（基因工程）→第三代疫苗（合成肽苗、抗独特型抗体疫苗）3、更加注重诊断用兽医生物制品4、向更浓缩、纯度更高方向发展5、更加注重免疫佐剂、灭活剂的研究6、更加注重产品的质量与冷链过程第三章免疫佐剂一、免疫佐剂的概念本身没有免疫原性，但与Ag联合使用，能大大提高Ag的免疫原性或改变免疫应答类型，这种物质为免疫佐剂二、免疫佐剂的要求1、安全、无毒副作用2、化学纯以上的试剂3、吸附能力强4、容易吸收5、稳定性强、能保存1~2年三、常用免疫佐剂的制备（一）不溶性铝盐胶体的佐剂1、Al（OH）3AlCl3（无水）+NaOH→Al（OH）3胶↓（滴定法）明矾+NH3▪H2O→Al（OH）3胶使用注意事项：①灭活菌液：Al（OH）3胶=4：1②Al（OH）3经126℃高压，30min灭菌后使用③Al（OH）3能诱导老年痴呆症④配制好的疫苗应摇匀后使用2、明矾佐剂（例：破伤风明矾沉降类毒素）制备：明矾10g+dH2O→10％明矾溶液（明矾佐剂）使用：500ml灭活菌液加10ml10％明矾佐剂（溶液）（二）油乳佐剂1、弗氏不完全佐剂（FIA）制备：液体石蜡油3份+无水羊毛脂1份+PH7.2PBS4份→混合，116℃30min使用：FIA：Ag=1：12、弗式完全佐剂（FCA）制备：FIA加入牛结核分支杆菌（冻干粉）10mg／ml混匀使用：FCA：Ag=1：1△FIA和FCA为免疫佐剂（实验用）3、白矿油佐剂（用于病毒疫苗）油相：①320ml10号白矿油（杭州杭联化工有限公司）②7g硬脂酸铝③22~24ml司本-80（span-80）④6ml吐温-80（Tween-80）把②加入①煮溶，冷却后，再加③、④水相：灭活病毒液150ml+6ml吐温-80制备油相：水相=7：3或6：4（高速搅拌，3min）（三）蜂胶佐剂30g蜂胶（研磨成粉）+500ml95％酒精→浸泡一周→4层纱布过滤→过滤液（佐剂）使用：500ml灭活菌液加15ml蜂胶佐剂特点：①没有什么毒副作用②吸收快③产生Ab快（7天产生保护性抗体）④抗体维持时间不长，不超过两个月第四章真快冷冻干燥技术（冻干）一、真空冷冻干燥技术将含有大量水分的生物活性物质冻结成固体，在真快条件下，利用减压升华原理，达到水分去除的目的。二、共熔点及其测定方法1、共熔点：使溶液或悬浊液完全凝固的瞬间温度2、测定方法：不同的生物制品有不同的共熔点，是依制品中组成成分而异。我们在进行冷冻干燥前，必须对其熔点进行测定，其熔点测定是根据导电溶液的电阻与温度相关关系的原理来测定，当温度降低时，电阻增大，当降到共熔点时电阻即出现突然增大的现象，此时的温度为该物质的共熔点。下面是一些保护剂的共熔点。表2-4一些物质的共熔点物质共熔点0.85%氯化钠溶液10%蔗糖溶液40%蔗糖溶液10%葡萄糖溶液2%明胶、10%葡萄糖溶液2%明胶、10%蔗糖溶液10%明胶、10%葡萄糖、0.85%氯化钠溶液脱脂牛乳马血清-220C-260C-330C-270C-320C-190C-360C-260C-350C三、冻干程序1、冻干前准备①将冻干物品分装，用广口瓶②盛装量1／5~1／4，厚度不超10mm③冻干物品含干物质量达4~25％2、预冻①将冻干物品置于-40℃②预冻时间3~4小时3、干燥①升华干燥阶段A在冷结条件下，利用减压升华原理将水分去除B可除去85%以上的水分C升华干燥时间与物质品种有关，凡共熔点高的物质升华时间短而易于干燥，共熔点低的物质升华时间要长且不易干燥②解吸干燥阶段A利用加热方式，将剩余水分去除B加热至25~30℃C压强维持25~30Pa4、加塞压盖四、冻干物品的特点1、多孔、疏松的结构物质，加水后能迅速溶解2、在真空冷冻下干燥，对热敏生物活性物质影响很小3、冻干后体积基本保持不变4、因水分去除，微生物处于休眠状态，便于保存和运输第五章灭活剂一、灭活的概念利用某些理化方法来杀死微生物和破坏毒素的生物学活性，使其失去致病性、繁殖力或脱去毒性，但其免疫原性基本保持不变二、灭活的方法1、物理方法：紫外线、射线、温度、超声波等（基本不用）2、化学方法；化学灭活剂（甲醛、结晶紫、乙烯亚胺类衍生物）三、常用化学灭活剂1、甲醛①最古典、应用范围最广的灭活剂②40％甲醛为福尔马林③甲醛遇光后发生聚合，灭活效能会降低④不能用于猪瘟和口蹄疫病毒灭活⑤细菌大都用0.3％甲醛灭活病毒0.05％~0.2％甲醛灭活毒素0.4～0.7％甲醛灭活⑥可用焦亚硫酸钠中和过量甲醛2、结晶紫：猪瘟病毒专用灭活剂3、乙烯亚胺类衍生物①口蹄疫病毒专用灭活剂②常用乙烯亚胺类衍生物：二乙烯亚胺（BEI）、2-乙基乙烯亚胺（EEI）③用量：0.05％（终浓度）④加入硫代硫酸钠中和过量的乙烯亚胺类衍生物4、缩水甘油醛（用于ND灭活优于甲醛）四、影响灭活效果的因素1、被灭活物品的种类与特性（细菌、病毒、外毒素等）2、灭活剂的种类与特性3、灭活剂的含量与浓度，在一定范围内，浓度和含量越高，灭活效果越好4、灭活的温度与时间，在一定范围内，灭活温度越高，时间越长，灭活效果越好，一般情况下，37℃灭活24小时5、有机物存在影响灭活效果：有机物（组织、血清等）存在下，灭活剂需加大用量，延长灭活时间第六章兽医生物制品生产基本技术一、菌毒种的选育与保存（一）菌毒种的分类1、按菌（毒）种的毒力分类：强毒、弱毒菌毒种2、按用途可分为：①生产用菌毒种②检验用菌毒种③工具用菌毒种（二）菌（毒）种的基本要求①具有良好的免疫原性和反应原性②具有可靠的安全性（针对弱毒（菌）种而言）③具有典型的生物学特性④具有遗传稳定性和一致性⑤历史及有关资料清楚完整（三）菌毒种选育1、强毒（菌）毒种：分离、纯化2、弱毒（菌）毒种：①人工致弱：细菌（物理、化学）、病毒（生物方法）②自然筛选（四）菌（毒）种保存①菌（毒）种冻干保存②菌种置于4~8℃保存，毒种置于-15~-20℃保存③标准菌（毒）种由中国兽药监察所保管、分发二、兽医生物制品的生产基本程序和原则（一）细菌性疫苗生产的基本程序与原则1、生产原则：①安全②高效③方便2、细菌性疫苗生产的基本程序①菌种②培养基a、牛肉汤：牛肉（去除脂肪、筋膜），绞碎、加入dH2O（按1：2（水）比例），煮沸30min，过滤（4层纱布、滤纸）、补足失水，加入1~2％蛋白胨，0.5％NaCl，煮溶，用1NNaCl调PH值至7.2~7.4，再加入0.1％的磷酸氢二钠，121.3℃（15磅）30min灭菌b、营养牛肉汤：牛肉汤+2％G+2％小牛血清+适量VB族c、鲜血琼脂：普通营养琼脂+3~5％脱纤血（兔血）（高温后，温度至45℃）d、普通营养琼脂：牛肉汤+1％琼脂粉121.3℃30mine、巧克力琼脂+3~5脱纤血（70~80℃）③菌种传代第一代：复苏37℃18~24小时第二代：整齐划一青壮年快速生长期37℃10~12h④细菌的大量增殖a、逐级培养：菌种接种5ml（37℃18~24h）％5~35ml（37℃10~12h）％5~3500ml(37℃24~30h灭活苗10~16h弱毒苗)b、培养温度：37℃特例：破伤风梭菌34℃钩端螺旋体29~30℃c、气体环境需氧厌氧兼性需氧（有氧＞无氧）兼性厌氧5、弱毒苗生产37℃培养10~16h收获，加入冻干保护剂、分装、冻干、加塞压盖、贴标签6、灭活苗生产37℃培养24~30h收获，加入0.3％甲醛溶液37℃灭活24h按4：1比例加入铝胶、摇匀、加塞压盖、贴标签7、质量检查①安全检查：正常用量的几倍甚至十几倍进行免疫观察②活菌检验：针对灭活菌，将灭活菌接种入牛肉汤或鲜血琼脂检验灭活菌苗有无活菌③活菌总数检验（针对弱毒苗）：a、比浊法b、平板稀释计数法④效力检验：定量免疫、定量攻击弱毒苗免疫后7天可以攻毒灭活菌免疫后15~20天可以攻毒（二）病毒性疫苗生产的基本原则与程序1、病毒的增殖方法a、易感动物b、敏感细胞（例如：猪睾丸细胞、猪肾细胞、犊牛睾丸细胞）c、敏感禽胚2、以禽胚为例①毒种：a、毒力与免疫原性成正相关b、传代（复壮）1~2代②病毒的大量增殖a、接种方法ⓐ绒毛尿囊腔9~11dⓑ绒毛尿囊膜9~11dⓒ卵黄囊5~18dⓓ羊膜腔9~12d弱毒苗→SPF（种蛋）：没有特定性抗原灭活苗→非免疫种蛋b、接种量：鸡胚0.1ml／枚鸭胚0.2ml／枚鹅胚0.3ml／枚c、复壮种毒稀释：1:100~10000NS稀释（青链，含双抗）d、弃24h内死亡胚：①细菌感染②机械损伤e、收获24~72h死亡胚的胚液（也可以收获胚体）③培苗：a弱毒苗：收