几种生物新技术的研究进展

三种生物新技术在微生物研究中的应用进展摘要：本文对几种时下比较热门的生物技术的应用原理、存在的问题和研究进展进行了简单阐述，并且结合自己研究的领域，浅析了这些新兴的生物技术在生物防治真菌中研究的实际应用。关键词：微生物新技术；基因编辑技术；RNA干扰技术；DNA芯片技术一、基因组编辑新技术：CRISPR–Cas近年来，随着生物技术突破性的变革及科学家们不断的努力，新的基因编辑技术不断涌现出来，出现了当下最热门最新型的CRISPR/Cas9基因编辑系统。近日，中国科学家利用该基因编辑技术对抑制狗骨骼肌生长的基因（MSTN）进行了敲除，培育出两只肌肉发达的“大力神”狗，成功构建了世界首个基因敲除狗模型。科研人员所使用的“基因编辑技术”，顾名思义，能够让人类对目标基因进行“编辑”，实现对特定DNA片段的敲除、加入等。而CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。1.CRISPR/Cas9基因编辑技术概述CRISPR/Cas9基因编辑技术是最近几年出现的一种由RNA指导Cas核酸酶对靶向基因进行特定DNA修饰的技术。它是细菌和古细菌为应对病毒和质粒不断攻击而演化来的获得性免疫防御机制。此系统的工作原理是crRNA(CRISPR-derivedRNA)通过碱基配对与tracrRNA(trans-activatingRNA)结合形成tracrRNA/crRNA复合物，此复合物引导核酸酶Cas9蛋白在与crRNA配对的序列靶位点处剪切双链DNA，从而实现对基因组DNA序列进行编辑；而通过人工设计这两种RNA，可以改造形成具有引导作用的gRNA(guideRNA)，足以引导Cas9对DNA的定点切割。作为一种RNA导向的dsDNA结合蛋白，Cas9效应物核酸酶是已知的第一个统一因子(unifyingfactor)，它能够共定位RNA、DNA和蛋白，从而拥有巨大的改造潜力。将蛋白与无核酸酶的Cas9(Cas9nuclease-null)融合，并表达适当的gRNA，即可靶定任何dsDNA序列，而RNA可连接到gRNA的末端，不影响Cas9的结合。因此，Cas9能在任何dsDNA序列处带来任何融合蛋白及RNA，这为生物体的研究和改造带来巨大潜力。2.CRISPR/Cas系统的灵感来源CRISPR/Cas9技术的灵感来源于细菌的一种获得性免疫系统。与哺乳动物的二次免疫应答类似，细菌在抵抗病毒或外源质粒入侵时，会产生相应“记忆”，来抵抗该种外源遗传物质的再次入侵，而这种获得性免疫正是由细菌CRISPR/Cas系统实现的。在细菌的基因组上，存在着串联间隔排列的“重复序列”，这些重复序列相对保守，我们称之为CRISPR序列（成簇的规律间隔的短回文重复序列）。首先，其中的“间隔序列”来源于病毒或外源质粒的一小段DNA，是细菌对这些外来入侵者的“记录”。病毒或外源质粒上，存在“原间隔序列”，“间隔序列”正是与它们互相对应。“原间隔序列”的选取并不是随机的，这些原间隔序列的两端向外延伸的几个碱基往往都很保守，我们称为PAM（原间隔序列临近基序），当病毒或外源质粒DNA首次入侵到细菌体内，细菌会对外源DNA潜在的PAM序列进行扫描识别，将临近PAM的序列作为候选的“原间隔序列”，将其整合到细菌基因组CRISPR序列中的两个“重复序列”之间。这就是“间隔序列”产生的过程。然后，当外源质粒或病毒再次入侵宿主菌时，会诱导CRISPR序列的表达。同时，在CRISPR序列附近还有一组保守的蛋白编码基因，称为Cas基因。CRISPR序列的转录产物CRISPRRNA和Cas基因的表达产物等一起合作，通过对PAM序列的识别，以及“间隔序列”与外源DNA的碱基互补配对，来找到外源DNA上的靶序列，并对其切割，降解外源DNA。这也就实现了对病毒或外源质粒再次入侵的免疫应答。正是基于细菌的这种后天免疫防御机制，CRISPR/Cas9技术应运而生，从而使科学家们利用RNA引导Cas9核酸酶实现对多种细胞基因组的特定位点进行修饰。3.CRISPR/Cas9存在的问题Cas9酶是基因编辑系统中一个非常关键的组成部分，而脱靶效应一直是CRISPR技术需要克服的重大技术问题。在任何临床应用之前，医生和监管机构必须确保Cas9酶不会引起非目标基因组的损伤。11月30日，发表在《科学》杂志上的一项研究中，麻省理工学院-哈佛医学院Broad研究所的研究小组又取得了一项突破性的成果。研究人员通过创建了3个新版本的Cas9酶大大降低了CRISPR/Cas9系统的脱靶效应；有效改善了这一技术的最大局限性之一。在这项研究中，科学家们利用了Cas9蛋白的结构知识来降低脱靶切割（off-targetcutting），即带负电荷的DNA是结合到带正电荷的Cas9蛋白的凹槽。基于这样的原理，他们预测，相较于“靶向”序列，用一些中性氨基酸来替代正电荷的氨基酸，可以减少Cas9与“脱靶”序列的结合。在试验了各种可能的改变后，张锋研究小组发现三个氨基酸突变可大大减少“脱靶”切割。利用测试的导向RNAs，研究人员证实“脱靶”切割已降低至检测不到的水平。研究小组将这种新设计的酶命名为“增强型”化脓性链球菌，可用于需要高水平特异性的基因组编辑应用。4.CRISPR/Cas9的应用前景CRISPR/Cas9技术在医疗健康、生产生活、家畜育种等领域的应用，不断取得喜人的新成果。如在医疗健康领域，用iPS细胞（诱导多能干细胞）治疗人类的镰刀形贫血症，可以将病人的皮肤细胞诱导成iPS细胞，利用该技术介导同源重组来修复发生突变的血红蛋白基因，再将修复的iPS细胞定向诱导分化为造血干细胞移植到病人体内。此外，像使用CRISPR技术根除HIV病毒、诱导宫颈癌细胞自我毁灭、构建癌症模型等最新成果先后被Nature等著名杂志所报道。在奶制品的发酵中，利用CRISPR/Cas9增强发酵菌株对噬菌体的防御能力；在家畜育种方面，也正在利用基因编辑工具通过对显着影响家畜生产性能的基因位点进行改良，以实现猪、牛、羊等大型家畜生产性能的提高等。但正如科学是把双刃剑，任何新技术的出现都少不了其反对者的存在，在该技术得到热烈呼声的同时，不少人也对它提出了质疑，特别是对其脱靶事件可能导致基因组其他位置产生未知突变表示担忧。作为生命科学领域的一项重大突破，CRISPR/Cas9的创新性、技术性毋庸置疑，随着对CRISPR系统认识的加深，实验设计的优化改造，相信其打靶效率会进一步提高，CRISPR/Cas9以及其衍生技术终究会带来一场科学史上的巨大变革。期待在不久的将来其所带来的巨大转变必将能够惠泽万家，到时候属于它的诺奖终将到来。二、RNA干扰技术1.RNA干扰技术概述RNA干扰(RNAinterference,RNAi)是由双链RNA(double-strandedRNA,dsRNA)所引起的序列特异性基因沉默，是真核生物中一种非常保守的机制，它与协同抑制(cosuppression)、转座子沉默(transposonsilencing)以及发育等许多重要的生物学过程密切相关。RNA干扰依赖于小干扰RNA(smallinterferenceRNA,siRNA)与靶序列之间严格的碱基配对，具有很强的特异性，涉及众多基因和蛋白复合物，构成了一个以小RNA为核心的真核基因表达调控系统，它可以在染色质水平、转录水平、转录后水平和翻译水平参与基因表达的调节。RNA干扰技术为人们迅速、准确的剖析基因的功能，分析基因之间错综复杂的联系和相互作用提供了极为有用的工具，同时也为人们预防和治疗癌症和病毒疾病提供了新的思路。作为一种进化上高度保守的抵御外源基因或外来病毒侵犯的防御机制RNAi广泛存在于各种生物体内，同时在生物生长发育中扮演着基因表达调控的角色，使人们重新认识了RNA在生命活动过程中的重要性。2RNAi发生的机制基因分析和生化研究证实RNAi共抑制及病毒诱导的基因沉默有着相似的作用机制。它们通过dsRNA引起的靶mRNA降解，阻抑翻译同源基因DNA甲基化或染色质结构修饰来发挥其调节作用通过对RNAi现象的遗传学与生物化学研究，其作用机制已日渐清晰。2.1靶mRNA的降解导入生物体的dsRNA在ATP供能下被Dicer复合物切割，生成约22个核苷酸的小干扰RNAsmallinterferingRNAsiRNADicer是一种蛋白复合物,含有RNA依赖的RNA聚合酶，和一个具有解链酶及激酶活性的核酸内切酶，RdRP不但能识别内外源性异常单链RNA将其转变为dsRNA后诱导RNAi的发生，而且在siRNA的信号扩增中起重要作用。Dicer中的核酸酶属于核糖核酸酶ⅢRNaseⅢ家族，它切割较长的dsRNA使其降解为多个22nt的能引起特异性RNAi的小双链RNA片段，即siRNA加工后的siRNA在其两条链的3＇端均含有2个未配对的核苷酸，且5＇端磷酸化siRNA随即与约360kD的蛋白结合形成无活性的RNA诱导的沉默复合物(RNA－inducedsilencingcomplexRISC)，其中包括一个解旋酶和一个核酸内切酶Slicer在ATP供能下RISC中的解旋酶将siRNA双链解开转变为活化的形式RISC反义siRNA介导该活化复合物识别并结合至靶mRNA最终，Slicer在无须ATP参与下切割靶mRNA发挥作用Dicer和Slicer相继在RNAi通路中发挥作用被认为是靶mRNA降解的主要路径。2.2翻译水平的调节细胞内70nt的茎－环结构或双链RNA前体转录物被Dicer-Argonaute复合物特异性识别后，降解成22nt5＇端为单磷酸基3＇端为羟基的单链小RNA分子，与相关蛋白结合成另一种RISC复合体可识别并结合靶序列的3′端非翻译区UTR抑制其翻译过程从而调控基因表达。目前在果蝇、线虫和哺乳类动物中发现了100多种内源性22nt的miRNA，它们中的很多功能仍不清楚，推测其在翻译水平调节基因的表达，研究较多的是线虫中的22nt的lin-4和let-7的RNA可通过抑制特异mRNA翻译导致其编码蛋白表达受抑，调控幼虫不同发育阶段间的移行，称为小时序(RNAsmalltemporalRNAstRNA)是miRNA的一部分。lin-4和let-7的一个显著特点是它们不能与其靶mRNA形成完全的碱基配对，而是包含凸出的未匹配核苷酸和G、U错配碱基，可能的解释是，在前一种mRNA水平调节机制中siRNA与其靶mRNA的完全序列互补导致该mRNA的酶切降解，而后一种翻译水平调节则是由于碱基配对不完全，不发生靶mRNA的切割RISC不再具有酶切活性，而获得了翻译抑制因子的作用，使核糖体延伸受阻，翻译过程即受到抑制。线虫中内源性的RNAi诱导子lin-4、let-7在蛋白合成水平发挥作用，虽然dsRNA在翻译水平调控基因表达在其他生物系统中并不确定，但let-7及其相关RNA在生物间高度保守的事实提示这种调控模型可能是RNAi控制细胞基因表达的更为广泛的机制。2.3基因组甲基化修饰及结构改变dsRNA诱导的RNAi除了在转录后水平发挥作用外，还可通过其他机制影响基因表达。植物中的dsRNA可以使与沉默触发子即siRNA同源的基因组位点甲基化，引起遗传学特性的改变。推测通过募集组蛋白乙酰化酶抑制转录来调控生命活动，这种甲基化不对称且不局限于CpG或CpXpG序列，如果甲基化发生在编码链，虽然基因沉默仍可在转录后水平发生，即PTGS但该基因位点的转录并不受明显影响，如该触发子与其靶基因启动子序列互补，该基因即可发生转录水平沉默transcrip-tionalgenesilencingTGS与PTGS的一过性特征不同，TGS很稳定并且能够遗传至下一代。研究表明，在植物、果蝇、线虫和真菌中，RNAi可通过改变染色体结构影响基因表达[7]。任何使转甲基酶MET1或染色体改建复合物DDM1发生改变的因素均可影响拟南芥中沉默的程度及其维持，在这些机制中RISC是一个很灵活