分子生物学综述

基于特定引物PCR的DNA分子标记技术研究进展摘要：PCR是一种选择性体外扩增DNA的方法，分子标记是继形态标记、细胞标记和生化标记之后发展起来的一种比较理想的遗传标记技术。SSR、SCAR、SRAP和TRAP是四种最新发展的基于特定引物PCR的新型DNA分子标记技术，具有简便、高效、重复性好等优点，已在遗传育种的种质资源等各个方面得到广泛应用。介绍了这四种分子标记的基本原理和特点，综述了它们在分子生物学研究中的应用。关键词：分子标记SSRSCARSRAPTRAPDNA分子标记技术的研究始于1980年，本质上是指能反映生物个体或种群间基因组某种差异的特异性DNA片段，DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现生物个体之间DNA差异，通常也称DNA的指纹图谱。与其他几种遗传标记相比具有的优越性有：大多数分子标记为显性，对隐性的农艺形状的选择十分便利;基因组变异及其丰富，分子标记的数量几乎是无限的；在生物发育的不同阶段，不同组织的DNA都可用于标记分析；分子标记揭示来自DNA的变异；表现为中性，不影响目标形状的表达，与不良性状无连锁；检测手段简单、迅速。目前DNA分子标记技术已有数十种，主要可分为4大类:基于分子杂交的DNA分子标记技术;基于随机/特定引物PGR的DNA分子标记技术;基子限制性酶切与PCR技术的分子标记技术;基于芯片技术的DNA分子标记技术。概述新型的基于特定引物PCR的DNA分子标记技术，包括SSR,SCAR,SRAP和TRAP。目前这些I3;VA分子标记技术的应用仍具有相当的局限性，如何将它们有效地利用于分子生物学研究是函待解决的问。1序列特异扩增区域SCAR1.1SCAR标记的原理序列特异扩增区域(sequencecharacterisedam-plifiedreginn)简称SCAR标记，是1993年Paran和Michelma记[1]]建立的一种可靠、稳定、可长期利用的RAPD标记技术。SCAR标记的基本流程:先用随机引物进行RAPD筛选，获取特异的RAPD标记，然后对标记进行克隆和测序，根据测定RADII标记两末端的序列设计一对引物，此引物通常包含有原来的RAPD引物序列，多为20-24，再用该引物对所研究的基因组DNA进行PCR扩增，这样就可以把与原来的RAPI3片段相对应的单一位点鉴定出来。1.2SCAR标记的特点SCAR标记方便、快捷、可靠，适合于大量个体的快速检测，结果稳定性好，重复性高。由干SCAR标记使用的引物长，因而试验的可重复性高，它克服了RAPD重复性欠佳的弱点，同时具有STS标记的优点，因此比RAPn及其他利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用要好，在分子标记辅助育种、种质资源鉴别等方面有着潜在的应用前景，SCAR标记是共显性遗传的。待检DNA间的差异可直接通过有无扩增产物来显示，这甚至可省却电泳的步骤。由于RAPD扩增过程中错配几率较高，RAPD标记片段同源性高导致SCAR标记的转化成功率较低，而由SRAP和I55R分子标记转化得到的。SCAR标记转化成功率较高。1.3SCAR标记的应用SCAR标记直接采用专一特异性引物进行PCR扩增，排除了随机引物结合位点之间的竞争，且避免了筛选引物、估算样品间遗传相似性和构建遗传聚类图的繁琐过程，稳定性和重复性得以显著提高。SCAR标记目前已被广泛用于农林经济作物的种质鉴定、分子标记辅助育种、遗传连锁图谱构建和基因定位等诸多领域[2]。吴学谦等[3]通过对香菇菌株IG2和申香1U号的RAPD分析中分别获得一个多态性片段，再将该片段转化为特异的SCAR标记，该标记能快速鉴定这两个菌株。谢宝贵等[4]将金针菇子实体白色基因连锁的RAPD标记转化为SCAR标记，认为可应用于白色金针菇良种选育，提高育种效率。Masuzeki等利用8对SCAR锚定引物构建洋葱的SCAR标记连锁图谱，并将此用于其他葱类的遗传分析。Shimada等在黄酮生物合成基因内含子长度多态性的基础上，建立SCAR标记，可有效鉴定龙胆草极其变种，从而保护育种者权利。假单胞菌可代替农药用于雪霉病的生物防治，Halm-berg等应用SCAR标记来有效监测假单胞菌的生物防治作用效果。2相关序列扩增多态性(SRAP)2.1SNAP标记的原理相关序列扩增多态性简称SRAP，是一种新型的基于PCR技术的分子标记系统，由美国加州大学蔬菜作物系LI与Q博士于2001年提出，又叫基于序列扩增多态性。该标记通过一对引物对开放读码框进行扩增，上游引物长17bp,5'端的前10bp是一段填充序列，紧接着是CCGG，它们组成核心序列及3'端3个选择碱基，对外显子进行特异扩增。下游引物长18bp,5'端的前10一11帅是一段填充序列，紧接着是AATT，它们组成核心序列及3'端3个选择碱基，对内含子区域、启动子区域进行特异扩增，因个体不同以及物种的内含子、启动子与间隔长度不等而产生多态性。2.2SRAP标记的特点SRAP标记测序显示多数标记为外显子区域，25条多态性带中16条序列GC含量超过35%，表明可能是外显子部分;Blast搜索表明，60%条带与已知基因序列高度一致，这就确认了SRAP产生的多数标记包含了可译框中的外显子。测序还表明SRAP多态性产生于两个方面:由于小的插入与缺失导致片段大小改变.而产生共显性标记;核昔酸改变影响引物的结合位点，导致显性标记产生。该标记的优点:多态性高、产率中等;重复性好;操作简单;在基因组中分布均匀:可显示大量的共显性标记;较易对扩增得到的目标片段进行测序;引物具有通用性，而且其正向引物可以与反向引物两两搭配组合，因此用少量的引物可组配得到多个引物对，提高了引物的使用效率，降低引物合成成本。2.3SRAP标记的应用SRAP分子标记系统主要应用于物种资源鉴定与评价、遗传图谱构建、绘制基因转录图谱、基因定位以及标记重要基因并克隆测序。该分子技术最早是在芸甚属作物开发出来,目前已在其他作物如马铃薯、水稻、生菜、油菜、大蒜、苹果、樱挑、柑橘与芹菜中也成功扩增。李翠翠等[5]利用SRAP分子标记对12个真姬菇进行遗传多样性分析，结果表明SRAP稳定性好，适于真姬菇的种内鉴定。金梦阳等构建了甘蓝型油菜的SRAP标记遗传图谱，得到了202个SRAP标记。朱坚等[6]将SRAP分子标记用于金针菇的种质资源分析。Peag等应用SRAP分析研究23个种群的红花及其两个近缘种种群的造传多样性，发现23个红花种群遗传差异较大，两个近缘种群间亲缘关系极为密切;运用SRAP标记对86个柑橘亚科柑橘属品种及其近缘种的遗传多样性和亲缘关系进行研究，共产生376个多态性片段，但他们在系统树上的差异并不明显，亲缘关系极近。Liu等首次将SRAP标记应用于自交系竺麻DIVA水平的变化的研究，为竺麻的杂交育种提供理论依据，结果发现巴西的竺麻品种可能为中国品种进化而来的。4靶位区域扩增多态性(TRAP)3.1TRAP标记的原理靶位区域扩增多态性简称TRAP，也是一种新型的基于PCR的植物基因型标记技术，由美国农业部北方作物科学实验室Hu与Vick于2003年提出。与SRAP,RAPD和AFLP等标记技术无须任何序列信息即可直接PCR扩增不同，TRAP技术是基于已知的cDNA或EST序列信息。它借助日益增长的庞大的生物序列信息利用生物信息工具和EST数据库信息，产生目标候选基因区多态性标记。TRAP技术是从SRAP技术改进而来的，SRAP使用两个任意引物，而TRAP是使用长度为16-20核昔的固定引物(fixedprimer)与任意引物(HF}11tI8I)如mC}o固定引物以公用数据库中的靶EST序列设计而来;任意引物与SRAP所用的一样，针对外显子和内含子的特点。设计为分别富含GC或AT核心区的任意序列。固定引物的设计步骤:从EST数据库中鉴别所需序列，再采用有关引物设计软件(如Prirner3等)设定核着酸序列合理长度(18个碱基)与最适、最大和最小Tm值(53,55,50}),最后选定最适的引物。任意引物设计完全同S1iAP技术，PCR扩增前5个循环采用35℃的退火温度，后35个循环采用5D℃的退火温度，每次TRAP-PCR反应在6.50%聚丙烯酸胺测序胶可产生54一900bp的片段34-50个。3.2TRAP标记的特点TRAP标记技术不但具有PAPD技术的操作简单、易于建立的特点。而且具有AFLP技术强大功能的优势，它是一种新的基于PCR的植物基因型标记技术，具有操作简单、重复性好、多态性丰富、效率高和稳定性好的特点。3.3TRAP标记的应用TRAP技术适用于在不同作物上用于各种目的的研究，包括遗传图谱的构建、重要性状基因标记、种质资源的多样性研究和鉴定评价、标记辅助选择育种、gDNA与。DNA指纹分析乃至图位克隆等方面。Hu等L})将TRAP标记运用于植物的基因分型研究。金梦阳等[3]构建了甘蓝型油菜的TRAP标记遗传图谱，得到了14个TRAP标记。杜晓华等「zs]用TRAP标记对多年生向日葵的1G个种进行了遗传多样性研究，建立的系统树与基于形态特征的分类结果相似。研究表明，TRAP可以有效地应用于接骨木的普通种、栽培种和野生选育种的遗传多样性评估。Hong等利用TRAP标记对天葵的遗传变异种进行评价研究，发现该TRAP标记系统非常适合于天葵选育种的分类鉴定。Alwal}等利用TRAP分子标记进行甘蔗种间杂交的连锁图谱和基因组分析研究，结果发现TRAP标记比A.FLP标记和SRAP标记的效果都要好，因为该标记具有靶基因定位功能。4SSR标记SSR标记又称为sequencetaggedmicrosatellitesite,简写为STMS，是目前最常用的微卫星标记之一。由于基因组中某一特定的微卫星的侧翼序列通常都是保守性较强的单一序列，因而可以将微卫星侧翼的DNA片段克隆、测序，然后根据微卫星的侧翼序列就可以人工合成引物进行PCR扩增，从而将单个微卫星位点扩增出来。由于单个微卫星位点重复单元在数量上的变异，个体的扩增产物在长度上的变化就产生长度的多态性，这一多态性称为简单序列重复长度多态性(SSLP)，每一扩增位点就代表了这一位点的一对等位基因。由于SSR重复数目变化很大，所以SSR标记能揭示比RFLP高得多的多态性。4.2SSR标记的特点SSR具有以下优点;（1）检测快速、信息量大;(2)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点;(3)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子;（4)所需DNA量少，即便降解了也能有效地分析鉴定出。SSR分析的缺点:在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息，如不能直接从DNA数据库查寻，必须针对每个染色体座位的SSR测定并找到其两端的单拷贝序列设计引物并筛选。因而使其开发成本高、工作量大。4.3SSR标记的应用SSR标记是物种的基因型鉴定与品种保护、种子纯度评价和种质保存、多样性研究、基因和QTL,分析、系谱分析和分子标记辅助选择育种、资源鉴定、连续图谱绘制和克隆并筛选大片段文库等领域的有用工具，是应用较为广泛的遗传标记。孙琦等，应用SSR标记进行了玉米遗传育种的研究。金梦阳等[3]甘蓝型油菜的SSR标记遗传图谱，得到65个SSR标记。Tang等利用SSH分子标记对14个花生属野生种和来自多个不同国家的24个花生栽培种进行亲缘关系研究，结果表明花生栽培种可被划分为两个主要类群和4亚类群。ZHAN等对48个高粱、苏丹草及其近缘种进行S5R标记研究，发现该48个样品可被聚为5个类群，且高粱和苏丹草关系十分密切，可归为同一品种阮唱，用12个SSR标记研究利古里亚和地中海的橄榄的种质差异，结果发现利古里亚橄榄的种质资源和多态性都略胜一筹。前景展望分子标记技术发展迅速，但在某些物种的应用仍具有相当局限性，如在食用菌研究中，开发的分子标记数量不足，难找到与目标基因紧密连锁的分子标记;分子标记对数量性状基因的精确定位有较大差距;试验程序未实现自动化，难以对大群体进行研究。随着生物信息学、比较基因组学,功能基因组学、基因表达的序列分析,D