产酶条件优化方案

滤纸条降解试验吸取纤维素降解菌种子液1ml接种到装有50ml赫奇逊培养液的250ml三角瓶中，瓶中放置1cm×6cm的新华Ⅰ号滤纸条，同时设置不加菌液的滤纸条作为对照，每个处理3个重复。置于30℃恒温摇床，200r/min振荡培养5d，观察各瓶中滤纸条溃烂情况。赫奇逊培养液：KH2PO41.0gMgSO4·7H2O0.3gCaCl20.1gNaCl0.1gFeCl30.01gNaNO32.5gpH7.2～7.3蒸馏水1000ml纤维素酶活的测定1CMC酶活测定取培养好的发酵液于4000r/min的条件下离心15分钟，上清液即为粗酶液。分别加入相对应菌株的粗酶液1mL，加入柠檬酸缓冲液1ml，再加入0.8%的羧甲基纤维素钠溶液1.5mL，震荡摇匀，将所有试管置于50℃的水浴锅中保温50min，保温完成后取出试管，加入2mLDNS显色剂，震荡摇匀，将各试管置于沸水浴中水浴加热5min，使DNS显色剂与还原糖充分反应，5min后取出试管用流水冷却，再用蒸馏水定容至20mL，将各试管摇匀后以葡萄糖标准曲线1号管作为对照，依次测定各菌株在紫外分光光度计540nm处的OD值，计算出平均值后，参照葡萄糖标准曲线查出还原糖的量。2FPA酶活测定取培养好的发酵液于4000r/min的条件下离心15分钟，上清液即为粗酶液。分别加入相对应菌株的粗酶液1mL，加入柠檬酸缓冲液1ml，再加入滤纸(1cm×6cm)一条，震荡摇匀，将所有试管置于50℃的水浴锅中保温50min，保温完成后取出试管，加入2mLDNS显色剂，震荡摇匀，将各试管置于沸水浴中水浴加热5min，使DNS显色剂与还原糖充分反应，5min后取出试管用流水冷却，再用蒸馏水定容至20mL，将各试管摇匀后以葡萄糖标准曲线1号管作为对照，依次测定各菌株在紫外分光光度计540nm处的OD值，计算出平均值后，参照葡萄糖标准曲线查出还原糖的量。3Avicelcellulase(Avicelase)500uLofenzymemixedwith1mLofAvicel(1%,w/v)fordeterminingtheAvicelaseactivity.详细见给你的那篇文献通过以上两种方法，测得复筛得到的酶活高的菌株每8h的粗酶酶活产酶曲线，测到72h。确定酶活达到最大的最适时间。产酶条件优化研究不用培养温度、pH值、碳源、氮源、接种量、装液量对菌株产酶的影响，并在各因子最适条件下培养菌株，检测其产酶酶活。(培养的时间均为酶活达到最大的最适时间)培养时间：生长曲线和产酶曲线1培养温度对产酶的影响。将复筛得到的酶活高的菌株分别接种于5个100mL的羧甲基纤维素培养基中（用250mL的三角瓶承装），并分别在25、30、35、40、45℃下培养，培养一定时间后，测定其CMC酶活，从而确定菌株产酶的最适温度。2培养起始pH对产酶的影响。将复筛得到的酶活高的菌株分别接种于5个100mL羧甲基纤维素培养基中，并将其起始pH值分别调至5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0。培养一定时间后，测定其CMC酶活，从而确定菌株产酶的最适pH值。3不同碳源对产酶的影响。分别以CMC-Na、微晶纤维素、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、果糖、可溶性淀粉、麦麸、乳糖为碳源代替基础培养基中的碳源，添加量均为10g/L，培养纤维素降解菌。培养一定时间后，测定其CMC酶活，从而确定菌株产酶的最适碳源。然后添加不同浓度(20g/L、30g/L、40g/L、50g/L、60g/L、70g/L、80g/L)的最适碳源代替基础培养基中的碳源，培养纤维素降解菌。培养一定时间后，测定其CMC酶活，从而确定菌株产酶的最适碳源的最适浓度。4不同氮源对产酶的影响。分别以胰蛋白胨、酵母浸粉、牛肉膏、NH4NO3、(NH4)2SO4、NH4Cl、KNO3、NaNO3、尿素、大豆为氮源代替基础培养基中的氮源，添加量均为2g/L，培养菌株。培养一定时间后，测定其CMC酶活，从而确定菌株产酶的最适氮源。然后添加不同浓度(1g/L、3g/L、5g/L、7g/L、9g/L、12g/L)的最适氮源代替基础培养基中的氮源，培养纤维素降解菌。培养一定时间后，测定其CMC酶活，从而确定菌株产酶的最适氮源的最适浓度。5不同接种量对产酶的影响。将复筛得到的酶活高的菌株分别以不同的接种量(1%、2﹪、4﹪、6﹪、8﹪、10﹪)接种于5个100mL的羧甲基纤维素培养基中，培养一定时间后，测定其CMC酶活，从而确定菌株产酶的最适接种量。6不同装液量对产酶的影响。25mL/250mL、50mL/250mL、80mL/250mL、100mL/250mL、150mL/250mL在最适条件下培养菌株根据以上结果，配制以最适碳源，氮源的培养基，最适起始pH值并在最适温度的条件下培养最适时间，测其酶活，做3个平行试验，取平均值。注：培养基配方羧甲基纤维素培养基：羧甲基纤维素钠10g、蛋白胨10g、Yeastextract（酵母浸粉）10g、NaCl5g、K2HPO41g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl20.3g，FeSO4·7H2O5mg，MnSO41.6mg，ZnCl21.7mg，CoCl22mg，pH调至7.2。基础培养基：NaCl5g、K2HPO41g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl20.3g，FeSO4·7H2O5mg，MnSO41.6mg，ZnCl21.7mg，CoCl22mg，pH调至7.2。酶（CMCase）特性研究（见英文文献）酶的特性研究1）pH值2）温度3）不同pH值对酶稳定性影响4）不同温度（热稳定性）对酶稳定性影响5）金属离子酶活性的影响1酶催化反应的最适条件1.1温度对酶活力的影响将CMCase测定中的水浴温度分别设为30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃，分别测定测CMCase和FPase，以最高酶活值为100%，得到并比较这两种酶处在不同温度的酶促反应中的相对酶活力，从而确定其最适酶促反应温度。1.2pH对酶活力的影响分别配制pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的柠檬酸缓冲液用于稀释粗酶液，然后用不同pH值的柠檬酸缓冲液分别配制浓度为1%的CMC-Na溶液，分别测定CMCase和FPase，以最高酶活值为100%，获得并比较两种酶在不同pH酶促反应中的相对酶活力，最后确定最适酶促反应pH值。2酶的稳定性研究2.1酶的热稳定性研究将稀释后的粗酶液分别置于30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃的水浴中恒温处理lh后，在最适酶促反应条件下测定不同温度处理后的CMCase和FPase剩余酶活力，以未做特殊处理的粗酶液作对照，评价两种酶的热稳定性。2.2酶的pH稳定性研究配制pH值为3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的柠檬酸缓冲液，分别加入粗酶液，在4℃下放置2h后，在最适酶促反应条件下测定剩余酶活力，以未用缓冲液处理的粗酶液的酶活力为对照，评价两种酶的pH稳定性。3金属离子对酶活力的影响用最适pH值的缓冲溶液配制终浓度为l0-3mol/L的Fe2+、Mg2+、Pb2+、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Co2+、Na+、Mn2+和K+的离子溶液，并对粗酶液进行稀释，在最适酶促反应条件下测定CMCase与FPase，把不加任何金属离子的具有相同的稀释倍数的粗酶液作为对照组，研究金属离子对CMCase与FPase的影响。