人促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤的影响

中国组织工程研究第20卷第23期2016–06–03出版ChineseJournalofTissueEngineeringResearchJune3,2016Vol.20,No.23P.O.Box10002,Shenyang110180·研究原著·吕刚，男，1978年生，天津市人，汉族，2002年河北医科大学毕业，主治医师。通讯作者：吕刚，天津医科大学研究生院，天津市津南区咸水沽医院脑系科，天津市300350中图分类号:R394.2文献标识码:B文章编号:2095-4344(2016)23-03432-07稿件接受：2016-03-30人促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤的影响吕刚1，2，张宏远2(1天津医科大学研究生院，天津市300350；2天津市津南区咸水沽医院脑系科，天津市300350)引用本文：吕刚，张宏远.人促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤的影响[J].中国组织工程研究，2016，20(23):3432-3438.DOI:10.3969/j.issn.2095-4344.2016.23.013ORCID:0000-0002-9370-1599(吕刚)文章快速阅读：文题释义：蛛网膜下腔：蛛网膜由很薄的结缔组织构成，是一层半透明的膜，位于硬脑膜深部，其间有潜在性腔隙为硬膜下腔，腔内含有少量液体。蛛网膜跨越脑，被覆于脑的表面，与软脑膜之间有较大的间隙，称为网膜下腔，腔内充满脑脊液。在特定部位，蛛网膜下腔扩展并加深，成为蛛网膜下池。其中最大的是小脑延髓池，它通过正中孔和前侧孔与第四脑室相通：桥池位于脑桥腹侧：脚间池位于脚间凹；交叉池位于视交叉前方。人羊膜间充质干细胞：是一种具有自我增殖能力和多向分化潜能的种子干细胞，在一定条件下其可分化成神经系统的各种细胞，在神经损伤修复方面具有广阔的应用前景。人羊膜间充质干细胞移植到受损伤的脑组织中，能产生新的神经细胞，可以促进脑的再生修复。但移植后人羊膜间充质干细胞向成熟神经元方向分化效率低，可能与脑损伤局部微环境改变有关，严重制约其在临床上的应用。摘要背景：有研究表明促红细胞生成素是一种调节骨髓造血功能的糖蛋白，不仅具有调节中枢神经系统发育作用，还可以营养神经及保护神经，但实验结果证实促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植成为治疗脑损伤的新途径。目的：观察促红细胞生成素修饰的人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤大鼠神经损伤后功能恢复的影响。方法：体外培养人羊膜间充质干细胞，构建真核表达质粒pcDNA3.1促红细胞生成素，并转染入人羊膜间充质干细胞。用Westernblot检测人羊膜间充质干细胞在转染前后人促红细胞生成素蛋白的表达。构建大脑中动脉闭塞模型大鼠，用促红细胞生成素修饰的人羊膜间充质干细胞尾静脉移植，并设模型组和人羊膜间充质干细胞组作对比。结果与结论：①转染结果鉴定：Westernblot结果显示，转染人促红细胞生成素基因的人羊膜间充质干细胞体外能表达人促红细胞生成素；②行为学变化、生长相关蛋白43及水通道蛋白9表达：神经功能评分，RT-PCR和Westernblot检测结果显示，人促红细胞生成素基因+人羊膜间充质干细胞组改良的神经功能缺损评分、脑组织生长相关蛋白43及水通道蛋白9基因及蛋白的表达明显小于其他2组(P0.05)；③细胞存活情况：人促红细胞生成素+人羊膜间充质干细胞组CM-Dil的阳性细胞数最多(P0.05)，人羊膜间充质干细胞组次之(P0.05)，脑损伤组最少(P0.05)。④结果证实，促红细胞生成促红细胞生成素修饰人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤大鼠神经功能恢复的影响人羊膜间充质干细胞基因尾静脉移植结局：(1)促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植可降低脑损伤区周围生长相关蛋白43及水通道蛋白9基因及蛋白的表达；(2)抑制神经细胞的凋亡；(3)促进神经功能恢复。脑损伤模型大鼠吕刚，等.人促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤的影响ISSN2095-4344CN21-1581/RCODEN:ZLKHAH3433:LvGang,SchoolofGraduate,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300350,China;DepartmentofBrainInjury,XianshuiguHospitalofJinnanDistrict,Tianjin300350,China素基因修饰人羊膜间充质干细胞移植可降低脑损伤区周围生长相关蛋白43及水通道蛋白9基因及蛋白的表达，抑制神经细胞的凋亡，促进神经功能恢复。关键词：干细胞；移植；人促红细胞生成素；干细胞移植；人羊膜间充质干细胞；脑损伤；大鼠；生长相关蛋白43；水通道蛋白9；基因；修饰；神经功能主题词：干细胞；组织工程；脑损伤Humanerythropoietin-modifiedhumanamnioticmesenchymalstemcellsviasubarachnoidtransplantationpromoteneurologicrecoveryfrombraininjuryLvGang1,2,ZhangHong-yuan2(1SchoolofGraduate,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300350,China;2DepartmentofBrainInjury,XianshuiguHospitalofJinnanDistrict,Tianjin300350,China)AbstractBACKGROUND:Studieshaveshownthatasaregulatorofbonemarrowfunctionerythropoietinisaglycoproteinthatcontrolsthedevelopmentofthecentralnervoussystemandhasneurotrophicandneuroprotectivepotential.Therefore,transplantationofhumanamnioticmesenchymalstemcellsgeneticallymodifiedbyhumanerythropoietinisanewchoiceforbraininjurytreatment.OBJECTIVE:Toobservetheeffectoftransplantationofhumanamnioticmesenchymalstemcellsgeneticallymodifiedbyhumanerythropoietinonthefunctionalrecoveryfrombraininjuryinrats.METHODS:EukaryoticexpressionplasmidpcDNA3.1carryingerythropoietinwassuccessfullyconstructedandtransferredintoamnioticmesenchymalstemcellsculturedinvitro.Expressionoferythropoietinwasdetectedusingwesternblotassaybeforeandaftertransfection.Ratmodelsofmiddlecerebralarterialocclusionwasmadeandgiventransplantationoftransfectedamnioticmesenchymalstemcellsviathetailvein(transfectiongroup).Additionally,modelandsimplecelltransplantationgroupsweresetinacomparativestudy.RESULTSANDCONCLUSION:Findingsfromwesternblotdetectionshowedthattransfectedcellscouldexpresshumanerythropoietin.Comparedwiththeothergroups,modifiedneurologicseverityscores,growth-associatedprotein43andaquaporin9atmRNAandproteinlevelswerealldecreasedsignificantlyinthetransfectiongroup.Furthermore,thenumberofcellspositiveforCM-Dilwashighestinthetransfectiongroup,followedbysimplecelltransplantationgroup,andlowestinthemodelgroup(allP0.05).Overallfindingsfromthisstudyshowthathumanerythropoietin-modifiedhumanamnioticmesenchymalstemcelltransplantationpromotesneurologicrecoveryfrombraininjurythroughelicitingareductioningrowth-associatedprotein43andaquaporin9atmRNAandproteinlevelsaswellasinhibitingcellapoptosis.Subjectheadings:StemCells;TissueEngineering;BrainInjuriesCitethisarticle:LvG,ZhangHY.Humanerythropoietin-modifiedhumanamnioticmesenchymalstemcellsviasubarachnoidtransplantationpromoteneurologicrecoveryfrombraininjury.ZhongguoZuzhiGongchengYanjiu.2016;20(23):3432-3438.0引言Introduction脑损伤也称为脑卒中，是严重威胁人们身体健康的一种脑血管疾病，多见于老年患者。随着中国老龄化社会问题的加快，以及各种导致脑血管病危险因素的增加，致使脑卒中的发病率在呈逐年增高，发病年龄也逐渐年轻化。脑损伤的发病机制及治疗又是一个较为复杂的过程，因此如何尽早研究出预防及治疗脑损伤的有效方案，一直是脑血管病专家关注的焦点[1-4]。国内外多项研究均认为人羊膜间充质干细胞是一种具有自我增殖能力和多向分化潜能的种子干细胞，在一定条件下其可分化成神经系统的各种细胞，在神经损伤修复方面具有广阔的应用前景[5-7]。研究表明，促红细胞生成素广泛存在于神经系统等各种组织中，对神经系统的发育、生长、维护和保护起着重要作用[8]。实验旨在探讨促红细胞生成素修饰的大鼠人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤大鼠神经损伤后功能恢复的影响。1材料和方法Materialsandmethods1.1设计随机对照动物实验。吕刚，等.人促红细胞生成素基因修饰人羊膜间充质干细胞蛛网膜下腔移植对脑损伤的影响P.O.Box10002,Shenyang110180