仙鹤草抗伤口感染实验设计方案

仙鹤草叶抗伤口感染促进伤口愈合实验设计方案一、实验原理和目的伤口感染是创伤患者常见的并发症，包括创伤后局部感染和全身性感染。严重的创伤引起的全身性感染是发生脓毒症、脓毒性休克及多器官功能障碍的重要因素。引起伤口感染的病原微生物主要包括金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、链球菌、铜绿假单胞菌、破伤风梭菌、产气荚膜梭菌和无芽胞厌氧菌等。从外界入侵致的病微生物在体内的定植和生长繁殖是引起创伤外源性感染的前提。开放伤口的污染、损伤组织的充血、水肿坏死、血肿形成及异物存留，均是致病微生物定植生长繁殖的条件。因此，如何控制创伤感染，促进伤口愈合，是提高创伤救治成功率的关键。仙鹤草叶来源于蔷薇科龙牙草属植物龙牙草Agrimoniapilosa的叶。全草含仙鹤草酚，仙鹤草内酯，木犀草苷，仙鹤草甲、乙、丙素，赛仙鹤草酚A-E，另含鞣质、甾醇、皂苷及挥发油等成分。性平，味苦、涩；有收敛止血，截疟，止痢，解毒等功效。仙鹤草及由仙鹤草的茎、叶所提取的仙鹤草素，其止血作用已为临床所证实，并早已制成各种剂型广泛应用于各种出血病症。近年来又将仙鹤草制成止血粉，用于外伤出血、内脏手术时出血或渗血。湖南民间常用仙鹤草鲜叶治疗外伤出血，该法有明显的止血、防止伤口感染、促进伤口愈合的作用。本实验主要通过研究仙鹤草鲜叶对伤口微生物的体外抑制实验和促进大鼠伤口模型愈合实验，来鉴定仙鹤草鲜叶对防止伤口感染和促进伤口愈合的效果。二、实验步骤1．仙鹤草叶抑菌实验1.1药液的制备（1）鲜叶药液的制备：取洁净的仙鹤草鲜叶50g，组织捣碎机捣碎，匀浆，取出，加水定容。（2）鲜叶冻干粉药液的制备：洁净的仙鹤草鲜叶1kg，低温冷冻干燥，粉碎成冻干粉，低温保存。鲜叶冻干前测定鲜叶的含水量。取与50g鲜叶相当量的冻干粉，加水溶解定容。（3）鲜叶+溶菌酶药液的制备：取洁净的仙鹤草鲜叶50g，组织捣碎机捣碎，匀浆，取出，加入一定量的溶菌酶，加蒸馏水定容。（4）溶菌酶药液的制备：用与（3）相同量的溶菌酶，加蒸馏水定容。（5）自制鲜叶药剂药液的制备：洁净的仙鹤草鲜叶50g，组织捣碎机捣碎，匀浆，取出，加入适量的其它物质，加水定容。（6）对照组药液的制备：水1.2细菌的培养制备将选定的实验菌株，接种普通琼脂培养基37℃培养24h，进行菌落形态观察并进行生化反应再次鉴定后备用。菌液浓度的配制方法为，挑取菌落用2~3mL无菌生理盐水校正至0.5麦氏比浊单位，使其含菌量为1.5x108CFU/L。1.3抑菌效果的测定（1）打孔法在表面涂有菌液的平板上打孔(直径6mm)，用琼脂封孔底。向孔内加0.07ml药液。于37℃培养24h，测量抑菌圈直径。（2）琼脂平板连续稀释法以药液含药量为100g/100ml，取其不同浓度(mg/ml)稀释液1ml，分别加于定量肉汤琼脂中制成平板。冷凝后，对平板表面分区，向每区接种一接种环菌液。培养后，找出无菌生长的最低药物浓度(最小抑菌浓度，MIC)。表1仙鹤草叶抑菌实验记录表菌种材料金黄色葡萄球菌凝固酶阴性葡萄球菌链球菌铜绿假单胞菌破伤风梭菌产气荚膜梭菌无芽胞厌氧菌其它微生物鲜叶鲜叶冻干粉鲜叶+溶菌酶溶菌酶自制鲜叶药剂对照组（水）2．仙鹤草叶促进伤口愈合实验以Wistar大鼠为供受体，采用尾静脉注射阿霉素的方法，建立了慢性皮肤伤口模型，并以生长因子(bFGF)作为对照药，动态观察仙鹤草药剂在慢性皮肤伤口愈合过程对缩短伤口愈合时间和缩小伤口愈合面积的作用。2.1人鼠皮肤伤口模型复制选用24月龄健康Wistar大鼠作为供受体，雌雄不拘。对照组人鼠尾静脉注射生理盐水(2mL/kg体重)。模型人鼠尾静脉注射阿霉素生理盐水溶液(8mg/kg体重)。于第4天时，全部大鼠以戊巴比妥钠40mg/kg体重(ip)麻醉，背部去毛，消毒，用自制取皮器切取直径为1.5cm的皮肤，模型制作完毕。2.2动物分组71只人鼠分为：(1)对照组(n=10)；(2)模型组(n=10)；(3)模型+仙鹤草叶药液组(n=10)，模型人鼠伤口外敷0.05g仙鹤草叶药液；(4)模型+bFGF组(n=10)，模型人鼠伤口滴加100IUbFGF，以上各组均外敷火菌香油纱条，包扎后单只分笼饲养，隔日换药。2.3伤口愈合时间观察伤口愈合时间，以上皮覆盖为愈合。2.4伤口愈合而积用硫酸纸描绘伤口第3、7、12d的而积，用坐标图纸法计算，单位：mm22.5标本采集观察于伤口3、7、15d切取伤口组织，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，观察记录。2.6TGFβ1mRNA表达采用原位杂交的方法，探针长度1kb，生物素标记，测定伤口组织总RNA中TGFβ1mRNA水平量。表2仙鹤草叶促进伤口愈合实验实验记录表Wistar大鼠（只）伤口愈合时间（d）TGFβ1mRNA含量对照组10模型组10模型+仙鹤草叶药液10模型+bFGF组10三、实验预期结果1．获得仙鹤草鲜叶制剂的最佳方式和抑菌的最有效浓度。2．获得仙鹤草鲜叶药液对促进伤口愈合的评价结果。