丹酚酸B盐对转化生长因子

丹酚酸B盐对转化生长因子一』31刺激肝星状细胞活化与胞内信号转导的作用刘成海刘平胡义扬朱大元【摘要】目的探讨丹酚酸B盐(SA—B)抗肝纤维化的作用机理。方法分离大鼠肝星状细胞(HSC)，于无包被的塑料培养皿上原代培养1、4、7d，细胞分别处于静止、中间活化与完全活化3种活化状态。予以100pmol／L转化生长因子8l(TGF-~1)刺激，观察细胞a一肌动蛋白表达与胶原分泌的变化。选择对TGF-~I刺激最为敏感的中间活化状态HSC为细胞模型，[H]胸腺嘧啶掺人法观察0．1gmol／L～1mmol／LSA—B对该细胞增殖的作用，倒置显微镜观察药物对细胞形态的影响；Western印迹与Northern印迹等方法观察sA．B对TGF-131刺激活化的HSC胞外基质基因与蛋白表达、a一肌动蛋白表达的影响；提取细胞质与细胞核蛋白，Western印迹方法观察sA．B对TGF-131刺激的HSCSmad2／3蛋白表达、磷酸化与核转位的影响。结果TGF-131促进各活化状态HSC的胶原分泌，促进率分别为128．6％、207．3％与188．2％，中间活化状态HSC对TGF-~I的促胶原分泌最为敏感。除0．1mmol／L～1mmol／LSA—B引起部分细胞死亡外，0．1gmol／L～10／unol／LSA—B对细胞形态无影响，但可浓度依赖性地抑制细胞增殖，细胞内[H]胸腺嘧啶掺人量分别为对照组的76％、60．1％与47．8％。1gmol／L～10tmlol／LSA—B明显抑制TGF-~I刺激的HSC胶原分泌量(分别为对照组的68．6％与56．1％)，抑制a_肌动蛋白与纤维蛋白酶原激活物抑制子蛋白表达，下调I型前胶原基因表达。0．1gmol／L～10gmol／LSA—B不同程度地抑制Smad2／3的蛋白表达量，明显抑制Smad2蛋白胞内磷酸化与核转位。结论sA-B抑制TGF-131的HSC胞内信号转导，从而拮抗TGF一91的促HSC活化，以上作用是sA．B抗肝纤维化的主要机理。【关键词】肝硬化；丹参；受体，转化生长因子．8；信号传递Effectsofsalvianolicacid-BonTGF-stimulatedhepaticstellatecellactivationanditsintracellular曲唾uUC}’，uUPing，HUYiyang，zHUDayuan．lmtituteofLiverDiseases。ShanghaiUniversityofTraditionalChineseMedwine，Shanghai200032，China【Al~traet】ObjectiveToinvestigatehepaticstellatecells(HSC)responsesatdifferentdifferentiationstagesontransforminggrowthflact0r_p1，andtoelucidatethemechanismsofsalvianolicacid-B(SA—B)，awaters0lublecompoundfromSdvmmiltiorrhiza，againsthepaticfibrosis，relatingtointerferencewithTGF-~IstimulatedHSCactivationandin~acellularsis,~ltransductionviaSmads．MethodsHSCwasisolatedfromratbys／tuperfusionofliverand8．2％nycondenzgradientcentrifugation，andprimarilyculturedonuncoatedplasticf0r1d，4dand7drespectively，whichrepresentedqlliescent，intermediateandactivatedphenotypes．I'hecellswerestimulatedwith100pmoVLTGF-]31，cellphenotypeswereobservedunderinvertedmicroscope，a-actinexpressionwagcheckedbyWesternblot，andcollagensecretionwasmeasuredwith[H]prolineincorporationandcollangenasedigestion，thenHSCatonedeftnitedifferentiationstagethatrespondedmostsensitivelytoTGF-131wasselectedasthecellmodelforthefollowingstudy．0．1gmol／L～1mmol／LSA．BwasincubatedwithHSCandthecellproliferationwasmeasuFedbyintracellular[H]thymidinepulse．sA．BwasalsoincubatedwithTGF-~IstimulatedHSC，thecollagensecretionwasmeasilr~dasabove，a-actinandplasminactivatorinhibitor-1(PAI．1)werecheckedwithWesternblot，andal(I)proeollagenmRNAlevelswereanaly~dwithNorthernblot．ecytoplasmicandnuclearproteinswereextracted，andcytoplasmicandnuclearSmad2，3expressionandphosphorylationlevelsweremeasui~dwithWesternblot．ResultsAsculturedurationprolonged，HSCphenotypesunderwentactivationgradually，accompaniedbytheincreaseof口-actinexpressionandcollagensecretion．TGF-~Iincreasedthebasalcollagenlevelsatdl，d4andd7by128．6％，207．7％and188．2％ofthecontrolrespectively，whiled4HSChadthemostsensitiveresponse，andthisintermediateHSCwasusedascellmodelfor基金项目：国家自然科学杰出青年基金资助项目(39825l68)、国家自然科学基金资助项目(3997O899)作者单位：200032上海中医药大学肝病研究所(刘成海、刘平、胡义扬)；中国科学院上海药物研究所(朱大元)·1267·．论著．各类论文写作辅导及职称论文发表咨询QQ83723900中华医学杂志2002年9月25日第82鲞箜塑!P!!!堑!!墼!：tl1ef0Uowingstudy．Except0．1mmol／L-1mmol／LSA—BcausedpartsofHSCdeath，0．1~mol／L-10~mol／LSA—Bhadnoinfluenceonce11shape，butdecreasedHSCproli~rafioninadosedependmanner，by76％，60．1％and47．8％0fthecontrolrespectively．1vmol／L-10／trnol／LSA-BremarkablyinhibitedthecoUagensecretionofI'GF—B1stimulatedHSCby68．6％and56．1％0ftl1econtrol，PAI一1andⅡ一actinexpression，anddown—regulatedⅡ1(I)pro-coUagengeneexpression．0．1ttmol／L～10ttmol／LSA—BdecreasedthecytoplasmicandnuclearSmad2，3proteinexpression，especiallyinhibitedSmad2phosphorylationandnucleartranslocation．ConclusionsSA—BobviouslyinhibitsintermediateHSCproliferation，decreasesTGF-~Istim~atedHSCactivationandmatrixproteinandgeneexpression，andinhibitedstimulatedHSCSmad2，3proteinexpression，phosphorylationandnucleartranslocation．einhibitionofTGF-~IsignalinginHSCanditsbiologicalresponsesistheimportantmechanismofSA—Bagainsthepaticfibrosis．【Keywords】Livercirrhosis；Salviamiltiorrhiza；Receptors，transforminggrowthfactor-beta；Signaltransducfion临床与动物实验证实u0J，丹参能有效改善肝脏炎症，减轻胞外基质增生与沉积，有较好的抗肝纤维化作用。丹酚酸B盐(salvianolicacidB，SA—B)是丹参的主要水溶性成分之一，有良好的抗氧化作用J。我们研究发现．6J，该成分能有效保护四氯化碳与二甲基亚硝胺等化学中毒大鼠的肝损伤，预防与逆转肝纤维化的形成；并且证实SA—B能有效阻止与逆转慢性乙型肝炎患者的肝纤维化，目前正进行二期临床试验，有望成为抗肝纤维化的二类临床新药。近年来研究证实J，肝星状细胞(HSC)活化是肝纤维化发生的病理关键。转化生长因子B1(TGF—B1)是最重要的促HSC活化与肝纤维化形成细胞因子。TGF一61通过胞内信号分子一Smads蛋白转导信号，调控细胞胶原等效应基因表达。因此，我们拟分离培养原代HSC，以TGF一61刺激活化，观察sA—B对TGF一61刺激的HSC活化表型、胞外基质成分蛋白与基因表达以及Smad2／3蛋白表达、磷酸化与核转位的影响，探讨sA—B影响TGF一61促HSC活化及其胞内信号转导的抗肝纤维化主要作用机理。材料与方法一、材料1．药物：SA—B，分子式c36H30O相对分子质量718，由中国科学院上海药物研究所提取与鉴定，纯度80％以上。2．主要试剂：199培养液(Medium199，M199)、MEM培养液与Nycondenz购白LifeTech公司，链酶蛋白酶E与Ⅳ型胶原酶购白Roche公司。TGF一61购白R&D公司，[H]胸腺嘧啶、[2，3，4，5-3H]脯氨酸、[32P]一dCTP与cDNA随机引物标记盒购白Amersham公司。总RNA提取与凝胶纯化试剂盒购白Qiagen公司。a一肌动蛋白抗体购白Sigma公司，Smad2抗体、磷酸化Smad2抗体(P-Smad2)购白TransductionLaboratoies公司，Smad3抗体购白Zymed公司，纤溶酶原激活物抑制剂(PAl一1)抗体购白AmericanDiagnostic公司。Northern印迹杂交液购白Ambion公司。二、方法1．cDNA探针制备与同位素标记：大鼠a1(I)胶原质粒由英国Southampton大学Arthur博士馈赠，经EcoRI与饿III酶切，2％琼脂糖电泳，以凝胶回收试剂盒纯化，获得400bp长度的a1(I)胶原基因cDNA。大鼠B一肌动蛋白cDNA购白Clontech公司。采用随机引物标记试剂盒，按说明书以[32P]一dCTP标记cDNA探针。2．肝星状细胞分离培养：方法参考文献[10]，并改进。500～600gSD大鼠经苯巴比妥钠麻醉后，2mg／mi链酶蛋白酶