产柠檬酸黑曲霉的筛选

产柠檬酸黑曲霉的筛选组长：高鸿飞组员：刘光明，何笑军，董慧，王志昆，胡明慧（西南大学药学院，重庆400716）【摘要】：以从西南大学各处土壤中分离得到的黑曲霉作为出发菌株，并对其进行了初步分离。利用酸分离法和变色圈法进行初步筛选，以产酸能力的强弱作为复筛指标，筛选到了一株稳定，高产柠檬酸的优势菌株。并利用正交实验法优选柠檬酸产生菌的最佳发酵培养基，紫外诱变育种法探究高产菌诱变的较佳时间。【关键词】：黑曲霉；酸分离法；变色圈法；筛选；正交试验；诱变柠檬酸又名枸橼酸，是目前以微生物发酵生产的重要有机酸之一。产柠檬酸的微生物包括真菌、细菌和酵母，黑曲霉是迄今为止产柠檬酸最佳的微生物之一。本次实验的目的是从土壤中筛选柠檬酸的黑曲霉高产菌株，并对其培养基的配置及最佳产酸条件进行探索，为今后进一步完善和优化其筛选工艺提供一定理论依据。1材料与方法1.1实验材料1.1.1出发菌种从西南大学食堂周围，山顶，试验田土壤中分离获得。1.1.2培养基察氏培养基成分硝酸钠3g磷酸氢二钾1g硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.5g氯化钾0.5g硫酸亚铁0.01g蔗糖30g琼脂20g蒸馏水1000mL制法：加热溶解，分装后121℃灭菌20min。1.1.3其他柠檬酸，可溶性淀，Deniges试剂，蔗糖NH4NO3，KH2PO4，MgSO4·7H2O，溴甲酚绿指示剂，氢氧化钠溶液，KMn044溶液1.2实验方法1.2.1黑曲霉筛选的流程土壤→稀释分离→变色圈平板→挑菌→纯化→摇瓶初筛→产物鉴定→复筛→正交实验→最优组合→诱变育种1.2.2黑曲霉的分离与鉴定采集表层以下5-10cm处土壤，称1.0g土壤迅速倒入装有玻璃珠的无菌水三角瓶中，配成10-2的土壤菌悬液，然后用移液管将其稀释到10-3、10-4、10-5倍。分别吸取10-3、10-4、10-5倍稀释液注入到酸分离培养基上以及涂布到察氏琼脂培养基上，静置5min后倒置于恒温培养箱内35℃培养3-4d，观察菌落形态特征，挑选出黑曲霉疑似菌株。1.2.3黑曲霉的初筛将上述所得菌种连续划线接种到初筛培养基平板上，在37℃的恒温培养箱培养3-4d后，发现菌落周围有黄色的变色圈（溴甲酚绿指示剂遇酸会产生颜色反应）。快速测定菌落及周围变色圈直径的大小，选择生长较快、变色圈与菌落直径之比相对较大者作为初筛菌株。并利用Deniges试剂(HgO1g溶于20ml0.2L／LH2S04中)鉴定柠檬酸和用0.1429mol/L的NaOH测定产酸量1.2.4黑曲霉的复筛将初筛到的黑曲霉（变色圈明显）接种到摇瓶培养基中，发酵3-5d，重复培养一次。然后用0.1429mol/L的NaOH溶液滴定10mL的发酵液，记录各自消耗NaOH的体积和计算产酸量。采用正交试验确定培养基浓度。选取四个主要影响因素：蔗糖、NH4NO、KH2PO4，MgSO4·7H2O每个因素各取三个水平，采用四因素三水平进行正交试验L9(34)以优势黑曲霉所产柠檬酸的产酸量为评价指标。这样各个营养成分的浓度也就较为容易地确定下来了。1.2.5柠檬酸鉴定及产酸量的测定柠檬酸鉴定利用Deniges试剂(HgO1g溶于20ml0.2L／LH2S04中)；取过滤液和对照液各约5ml，放入试管内，加Deniges液lml，在酒精灯上缓缓加热至沸。逐滴加入20g／LKMn04溶液。若有柠檬酸存在，则出现白色沉淀。产酸量的测定，方法如下：将过滤液充分摇匀，取10mL于150mL锥形瓶中，滴加2滴酚酞作指示剂，0.1429mol/LNaOH滴定酸度。1.2.6紫外照射诱变育种紫外诱变基本流程示意图：水洗稀释成106个/ml出发菌株→孢子悬浮液→待处理液紫外线射分离单孢子点种处理液→平板→培养成熟→平板选菌摇瓶培养→培养成熟→测酸度2结果与分析2.1在初筛培养基上用肉眼观察菌落特征：平板培养基上初为白色、平坦，后中心微隆变黄色，再变棕黑色。培养3-4d后然后挑取平板上单菌落的菌株黑色的孢子丝到显微镜上观察。查文献可知菌丝特点为：初生菌丝为白色，菌丝较长，呈绒毛状；基内菌丝透明，有横隔；部分菌丝特化的壁厚、膨大的足细胞，顶囊明显膨大，多成球形，表面生辐射壮小梗，顶端分生孢子串生。但实验中并未观察到。2.2黑曲霉的初筛由于初筛培养基中加有溴甲酚绿指示剂，黑曲霉产柠檬酸与之反应，在菌落周围形成一个透明的变色圈。变色圈与菌落直径比例大小对产酸的影响，见表1。表1变色圈与菌落直径比例大小对产酸的影响菌落序号变色圈直径/菌落大小产酸量A11.70.07A22.30.15一般认为，变色圈与菌落直径比例越大，菌株的产酸能力越强。这是因为透明的变色圈是柠檬酸与溴甲酚绿反应的旺盛、产酸能力强。2.3黑曲霉的复筛复筛的主要目的：①考查菌株生产能力的自然波动范围；②复筛的菌种经过斜面传代，在摇瓶复筛中考查菌种的传代稳定性；③选出稳定、高产的菌株。结果产酸量的测定：A1：0.12g/100mlA2：0.10g/100ml相比与初筛时的产酸量，可见A2的传代稳定性较差。A1为稳定高产菌株，斜面留种保存。2.4正交试验为了优选最佳发酵培养基，需要确定好各培养基之间浓度。通过测定在各种成分不同浓度的产酸率，再运用正交试验确定最佳浓度组合。选取四个主要影响因素：蔗糖、NH4NO、KH2PO4，MgSO4·7H2O每个因素各取三个水平，采用四因素三水平进行正交试验L9(34)正交试验结果及数据处理见表2和表3。表2因素水平表水平因素蔗糖（%）NH4NO3（%）KH2PO4（%）MgSO4·7H2O（%）ABCD1100.10.050.12150.20.10.253200.30.20.5表3正交试验L9(34)表实验号列号A（蔗糖）一因素B（NH4NO3）二因素C（KH2PO4）三因素D（MgSO4·7H2O）四因素产酸量(g/100ml）11（10%）1（0.1%）1（0.05%）1（0.1%）X1,X121（10%）2（0.2%）2（0.1%）2（0.25%）X2,X231（10%）3（0.3%）3（0.2%）3（0.5%）X3,X342（15%）1（0.1%）2（0.1%）3（0.5%）X4,X452（15%）2（0.2%）3（0.2%）1（0.1%）X5,X562（15%）3（0.3%）1（0.05%）2（0.25%）X6,X673（20%）1（0.1%）3（0.2%）2（0.25%）X7,X783（20%）2（0.2%）1（0.05%）3（0.5%）X8,X893（20%）3（0.3%）2（0.1%）1（0.1%）X9,X9把每一个因子取各水平的三次实验结果取平均值，即k1=(20.0+35.0+25.0)/3=27.0，同理可以得出各水平的k1,k2,k3;各水平的极差Rj就可以根据最大的k值与最小的k值之差获得。极差R越大，说明该因子的水平变动时，实验结果变化越大，从而可按极差大小来决定因子主次顺序。此外，K1,K2,K3值的大小反映了各水平对实验结果的影响，因而最大的K值对应了最好的水平。正交试验结果见表4。表4正交实验结果试验号A（蔗糖）B（NH4NO3）C（KH2PO4）D(MgSO4·7H2O）产酸量（g/100ml）111110.23212220.23313330.36421230.19522310.32623120.20731320.27832130.12933210.23K10.270.230.180.26K20.240.190.220.23K30.210.260.320.22优水平A1B3C3D1Rj0.060.070.140.04主次顺序CBAD本实验采用极差分析也称直观分析法分析正交试验结果。优点是直观,简单,其使用范围也比较广,因此它是正交实验中最常用和最有力的工具。但它的缺点是分析结果比较粗糙,往往不能从理论上给予确切的说明,特别是第一类判别因子的主次问题,当实验结果存在有混杂现象时,往往会得出错误的结论。另外还可用方差分析法。方差分析法是实验设计中传统的方法,其优点是通过统计分析的方法排除实验误差的干扰,得出比较科学的实验结论。但方差分析由于计算复杂,所以在多因子实验中主要用于判别因子的主次或者判别因子作用的显著性这个问题。采用直观分析法对结果进行极差分析，比较三因素的R值，由表4可以计算并判断A,B,C,D4个因素的优水平组合，即蔗糖10%，NH4NO30.3%，KH2PO440.2%，MgSO4·7H2O0.1%。比较各因素的Rj值可见CBAD。因素对试验指标影响的主次顺序是KH2PO4＞NH4NO3＞蔗糖＞MgSO4·7H2O,即KH2PO4对发酵的影响最大；其次是NH4NO3，蔗糖；而MgSO4·7H2O的影响相对较小。2.4紫外照射诱变育种，见表5.表5诱变育种变色圈法结果诱变时间变色圈大小/菌落大小45s260s2.1775s290s1.9105s1.83120s3135s2.3150s2.17165s1.67取变色圈比值较大的前五个，即诱变120s,135s,150s,75s,45s的平板进行摇瓶培养。5天后产生菌体球和柠檬酸，液体颜色较浅。诱变150s的菌种用0.1429mol/L的滴定10ml的发酵液，消耗NaOH溶液量为0.09g/100ml，比原黑曲霉的产酸能力有所下降，即发生负突变。其他的没产生菌体，可能由于接种失败。结果：没有通过紫外诱变的方法得到期望的高产菌。3讨论通过分离、初筛和复筛等操作，从土壤中获得一株优势产柠檬酸的黑曲霉，并利用正交实验法优选柠檬酸产生菌的最佳发酵培养基，紫外诱变育种法探究高产菌诱变的较佳时间。结果表明，该黑曲霉的最适的发酵培养基的组成和配比分别是蔗糖10%，NH4NO30.3%，KH2PO440.2%，MgSO4·7H2O0.1%。当诱变120s时变色圈最大。这比一般的筛选方法筛选到的黑曲霉产酸量要高一些，产酸率得到了一定的提高，为柠檬酸液体发酵工业的生产和今后的理论研究提供了一定理论依据，具有重要的实际意义。在产柠檬酸黑曲霉的分离过程中，人们常以溴甲酚绿指示性平皿培养基上黄色指示圈直径之比（R值）的大小作为初筛依据，进行大规模淘汰，以提高筛选效率。但R值的大小与产酸有多大的相关性仍无定论,在小范围内透明圈与菌落的直径之比并不与产酸能力大小简单对应，它只能作为初筛依据。因此，需要创新性地设计效率高的科学筛选方案和手段，以达到最少的工作量，在最短的时间内取得最大筛选效果的目的。本实验所以只以这种方法作为初筛，复筛时着重以其最本质的因素（产酸量）作为指标，综合考虑避免实验设计上的错误。筛选到的高产柠檬酸菌株如何保藏是一个很重要的问题。许多微生物存在自发突变和回复突变，虽然突变的概率比较低：10-8-10-9之间，但在繁殖的过程中会表现出来，菌种传代次数越多，产生突变的机率就越大。因此，要有好的保藏方法防止菌种退化。中期保藏用到沙土管（霉菌孢子耐干燥能力强），长期保藏用到真空冷冻干燥保藏，可以保藏十年之久。此外，定期分离纯化和减少传代次数也很重要。定期分离纯化可使菌种的生产性能逐渐提高，个别适宜的变异可以通过自然选择得到保存和发展。对柠檬酸生产菌种，人们可以通过定期分离纯化有意识的筛选个别正变菌就会高产稳产。退化是在繁殖过程中进行的，故要在不影响菌种生理性能的情况下严格控制传代次数。菌种传代的次数越少，它产生突变的几率就越低。