6 应用生物技术(第六部分)3

第15章人类基因组的克隆从人类基因组计划（HGP）说起(humangenomeproject)60年代初，美国总统Kennedy提出两个科学计划：登月计划攻克肿瘤计划人类遗传信息的复杂性人类基因组计划(HGP，HumanGenomeProject)目标：整体上破解人类遗传信息的奥秘为什么提出HGP？基因组(Genome)：包含细胞或生物体全套的遗传信息的全部遗传物质。原核生物(细菌、病毒等)真核生物(真菌、植物、动物等)人类基因组：3.2×109bp人类基因组计划准备用15年时间，投入30亿美元，完成人类全部24条染色体的3×109脱氧核苷酸对(bp)的序列测定，主要任务包括作图(遗传图谱、物理图谱的建立及转录图谱的绘制)、测序和基因识别。其中还包括模式生物(如大肠杆菌、酵母、线虫、小鼠等)基因组的作图和测序，以及信息系统的建立。作图和测序是基本的任务，在此基础上解读和破译生物体生老病死以及和疾病相关的遗传信息HGP的历史回顾1984.12犹他州阿尔塔组织会议，初步研讨测定人类整个基因组DNA序列的意义1985Dulbecco在《Science》撰文“肿瘤研究的转折点:人类基因组的测序”美国能源部(DOE)提出“人类基因组计划”草案1987美国能源部和国家卫生研究院（NIH）联合为“人类基因组计划”下拨启动经费约550万美元1989美国成立“国家人类基因组研究中心”，Watson担任第一任主任1990.10经美国国会批准，人类基因组计划正式启动JamesWatsonWalterGilbert1995第一个自由生物体流感嗜血菌(H.inf)的全基因组测序完成1996完成人类基因组计划的遗传作图启动模式生物基因组计划H.inf全基因组Saccharomycescerevisiae酿酒酵母Caenorhabditiselegans秀丽线虫1997大肠杆菌(E.coli)全基因组测序完成1998完成人类基因组计划的物理作图开始人类基因组的大规模测序Celera公司加入，与公共领域竞争启动水稻基因组计划1999.7第5届国际公共领域人类基因组测序会议，加快测序速度大肠杆菌及其全基因组水稻基因组计划2001年2月15日《Nature》封面2001年2月16日《Science》封面1999.7第5届国际公共领域人类基因组测序会议，加快测序速度2000Celera公司宣布完成果蝇基因组测序国际公共领域宣布完成第一个植物基因组——拟南芥全基因组的测序工作2000.6.26公共领域和Celera公司同时宣布完成人类基因组工作草图2001.2.15《Nature》刊文发表国际公共领域结果2001.2.16《Science》刊文发表Celera公司及其合作者结果Drosophilamelanogaster果蝇Arabidopsisthaliana拟南芥HGP的最初目标通过国际合作，用15年时间(1990～2005)至少投入30亿美元，构建详细的人类基因组遗传图和物理图，确定人类DNA的全部核苷酸序列，定位约10万基因，并对其它生物进行类似研究。4张图：HGP的终极目标阐明人类基因组全部DNA序列；识别基因；建立储存这些信息的数据库；开发数据分析工具；研究HGP实施所带来的伦理、法律和社会问题。遗传图物理图序列图转录图•遗传图谱（geneticmap）又称连锁图谱(linkagemap)，它是以具有遗传多态性（在一个遗传位点上具有一个以上的等位基因，在群体中的出现频率皆高于1%）的遗传标记为“路标”，以遗传学距离（在减数分裂事件中两个位点之间进行交换、重组的百分率，1%的重组率称为1cM）为图距的基因组图。遗传图谱的建立为基因识别和完成基因定位创造了条件。遗传图谱间期前期I同源染色体形成配对中期I晚期I发生交换前期II中期II晚期II末期II配子遗传连锁图：通过计算连锁的遗传标志之间的重组频率，确定它们的相对距离，一般用厘摩（cM，即每次减数分裂的重组频率为1%）表示。back物理图谱•物理图谱（physicalmap）是指有关构成基因组的全部基因的排列和间距的信息，它是通过对构成基因组的DNA分子进行测定而绘制的。绘制物理图谱的目的是把有关基因的遗传信息及其在每条染色体上的相对位置线性而系统地排列出来。转录图谱•转录图谱是在识别基因组所包含的蛋白质编码序列的基础上绘制的结合有关基因序列、位置及表达模式等信息的图谱。通过定位克隆技术寻找疾病基因的过程back序列图谱•随着遗传图谱和物理图谱的完成，测序就成为重中之重的工作。DNA序列分析技术是一个包括制备DNA片段化及碱基分析、DNA信息翻译的多阶段的过程。通过测序得到基因组的序列图谱大规模基因组测序大规模测序基本策略逐个克隆法：对连续克隆系中排定的BAC克隆逐个进行亚克隆测序并进行组装（公共领域测序计划）全基因组鸟枪法：在一定作图信息基础上，绕过大片段连续克隆系的构建而直接将基因组分解成小片段随机测序，利用超级计算机进行组装（美国Celera公司）运用计算机软件进行序列拼接back人类基因组人类基因组的组成线粒体基因组(16.6kb)细胞核基因组(3200Mb)基因外序列基因和基因有关序列约10%约90%专一或中等重复序列Non-codingDNA假基因内含子基因片段10%90%专一的或低拷贝数序列中度至高度重复序列20~30%70~80%分散重复序列串联重复序列/成簇重复序列约60%约40%蛋白编码基因rRNA基因tRNA基因CodingDNA人类基因组构成——24条染色体和线粒体=9606基因识别•基因识别（geneidentification）是HGP的重要内容之一，其目的是识别全部人类的基因。•基因识别包括：识别基因组编码区识别基因结构•基因识别目前常采用的有二种方法：从基因组序列中识别那些转录表达的DNA片段从cDNA文库中挑取并克隆。人类基因组计划的实施意义•人类基因组计划为我们研究生物信息的组织、结构、遗传、表达带来了极大的方便，使人类对自身有一个根本的了解。•人类是最高级、最复杂、最重要的生物，如果搞清楚人类基因组，那么再研究其它的生物就容易得多。•研究多种模式生物基因组将有助于研究地球生物的进化史。第一节基因治疗的回顾及现状第二节基因治疗中的基因转移载体第三节基因治疗中外源基因导入的化学和物理方法第四节基因治疗的方式第五节反义疗法与RNA干涉第六节通过核酶进行基因治疗第七节癌症的基因治疗第八节其他疾病的基因治疗第九节基因治疗的前景第16章人类疾病的基因治疗第一节基因治疗的回顾及现状根据临床统计：25%的生理缺陷、30%的儿童死亡、60%的成年人疾病都是由遗传疾病引起的。基因治疗（genetherapy）——向靶细胞或组织中引入外源基因DNA或RNA片段，以纠正或补偿基因的缺陷，关闭或抑制异常表达的基因，从而达到治疗的目的。基因治疗的基本思想：（20世纪80年代提出）随着对遗传疾病致病机理的深入研究，人们自然就想到如果能够使变异基因和异常表达的基因变为正常基因和正常表达基因，那么就可从根本上治愈遗传疾病。最早在人体进行的基因治疗试验是在1973年，由一名美国科学家和几名医生在德国进行的，病人是俩姐妹，当时分别为2岁、7岁，她们由于体内缺少一种稀有酶，而呈明显的精神痴呆，将肖普氏乳头瘤病毒注入患者，因为该病毒携带一种酶基因有可能使病人本身的酶分泌恢复正常，结果是既无疗效也无副作用。（未成功！）第二例基因治疗是在1980年，美国的一名医生对两名地中海贫血患者进行基因治疗，结果也未成功。由于他的试验未得到NIH的批准，受到社会广泛抨击。20世纪80年代初期，安德森（Anderson）博士首先阐明了基因治疗的前景及其发展方向。之后的几年内大批科学家在动物身上进行了大量的基因转移（genetransfer）和基因标记（genemarking）实验，为基因治疗的临床应用奠定了理论基础，也积累了经验。1990年9月14日，由美国NIH及其下属重组DNA顾问委员会（recombinantDNAadvisorycommittee，RAC）终于批准了美国第一例临床基因治疗申请，患者是一个患SCID的年轻姑娘，治疗取得成功。1991年，Rosenberg等人对50名黑色素瘤晚期患者进行基因治疗，也取得了一定效果。美国是世界上最早开展基因治疗的国家，也是目前开展基因治疗最多的国家。此外，英国、意大利、荷兰、日本和中国也都是世界上较早开展基因治疗的国家。据统计，1993年美国基因治疗中癌症患者为12万人，自身免疫疾病患者为15万人，病毒性疾病为30万人，创伤治愈1.2万人，其他遗传疾病2000人，按每人10000美元计算，医药费高达58亿美元。中国1991年7月开始了基因治疗的临床研究，由复旦大学进行的“成纤维细胞基因治疗血友病B”项目，1993年5月5日卫生部药政司颁布了管理依据。存在的问题：①如何选定并获得用来进行基因治疗的目的细胞；②如何将经过修正的目的细胞重新引入患者体内；③转入的正常基因的过量表达是否会造成新的疾病；④转基因的细胞能否在体内进行增殖，等等。基因治疗的方法：①体外-原位（exvivo）基因治疗；②体内（invivo）基因治疗；③反义疗法（antisense）；④核酶（ribozyme）基因治疗。第二节基因治疗中的基因转移载体要将目的基因转移进受体细胞，首先必须选择合适的基因载体。常用的方法是将病毒作为基因转移的载体。由病毒介导的基因转移方法有两种：▲重组反转录病毒介导的基因转移；▲重组DNA病毒介导的基因转移。下面介绍基因治疗中常用的病毒载体：一、反转录病毒载体（retrovirusvector）二、腺病毒载体（adenovirusvector，AVvector）三、腺病毒相关病毒载体（adenoassociatedvirus，AAV）四、重组痘苗病毒载体（vacciniavirus，VV）五、单纯疱疹病毒载体（herpessimplexvirus，HSV）六、染色体外自主复制载体一、反转录病毒载体（retrovirusvector）为单链正链RNA病毒，包括：▲双表达载体（dualexpressionvector，DEvector）▲内部启动子载体（internalpromotervector，IPvector）▲自失活载体反转录病毒载体作为基因转移的载体具有以下优点：①能稳定地将DNA插到宿主基因组的随机位点上，对宿主基因来说，整合是随机的，而对病毒基因组来说，整合是精确的，也就是说整合的病毒DNA结构是已知的；②能高效地感染宿主细胞，可以将遗传信息传递给大量受体细胞，细胞感染率可达100%；③反转录病毒的侵染范围非常广泛，可以浸染不同的生物种和细胞类型；④整合的原病毒在宿主基因组中比较稳定，而且拷贝数目较低；⑤用反转录病毒感染哺乳动物细胞，对宿主细胞没有毒性作用；⑥反转录病毒中包装的外源DNA序列可以达到10kb。二、腺病毒载体（adenovirusvector，AVvector）为线状双链DNA病毒。腺病毒载体作为基因治疗载体的优点：①比较安全，在美国已使用20年，无致病、致癌、致畸作用；②其宿主细胞范围较广，能感染复制分裂及不复制分裂的细胞，如神经细胞；③其可以在呼吸道和肠道中繁殖，因而不仅可以通过静脉注射的方式进行基因治疗，还可以通过口服、喷雾、气管内滴注等方法；④腺病毒载体中插入的外源基因可达7.5kb；⑤腺病毒容易制备、纯化和浓缩，能够满足基因治疗的临床需要；⑥腺病毒的基因结构与功能及其生活史目前了解较为清楚，用它作载体治疗比较容易控制。三、腺病毒相关病毒载体（adenoassociatedvirus，AAV）为正链DNA或负链DNA→形成双链DNA。优越性：①腺病毒相关病毒的反向末端重复序列中没有转录调节元件，这样可以减少利用这种载体进行基因治疗时激活原癌基因的可能性；②其宿主细胞范围较广，