《发酵工程》实验指导书

第-1-页共13页微生物发酵工程实验指导王金华实验规则1、实验前必须预习实验指导书。若经提问发现没有预习者，须在教师指定的时间内预习完毕，方得参加实验。2、实验前须认真检查仪器、试剂、用具及实验材料。如有破损、短缺应立即报告指导教师，经同意后方可调换和补充。对玻璃器皿须做好清洗工作。3、实验过程中不得随便挪动外组的仪器、用具和实验材料。不得随意拨动仪器开关或电源开关，须按实验要求进行。4、实验材料、药品的使用，应在不影响实验结果的前提下注意节约，杜绝浪费。5、实验室应保持肃静，不得谈笑喧哗，不许搞其他动作，以免影响他人实验。6、清洗仪器、用具、材料时，须将固形物倒入指定容器内，不得直接倒入水槽，以免造成水管堵塞。7、实验过程中，须按操作规程仔细操作，注意观察试验结果，应及时记录。不得抄写他人的实验实习记录，否则，须重做。如有疑问，应向指导教师询问清楚后方可进行。8、实验完毕后，须将玻璃仪器、用具等清洗干净，按原来的位置摆设放置。如有破损须报告指导教师，并填写仪器损坏登记簿。9、在进行实验过程中，不得随意食用原料和加工品。10、实验结束后，由值日生负责打扫实验室，保持室内整洁，注意关上水、电、窗、门。第-2-页共13页实验一培养基的配制及灭菌一、实验目的要求掌握不同类型微生物培养基的配方及其制备方法。二、仪器设备及原材料高压灭菌锅，250ml三角瓶，纱布，牛皮纸，琼脂，其他化学药品三、常用培养基的配方及制备1、细菌常用培养基（1）LB培养基蛋白胨1.0%酵母膏0.5%NaCl1.0%可溶性淀粉0.5%琼脂2.0%pH7.0121.3℃灭菌20min。（2）MRS（乳酸菌分离）牛肉膏0.5%酵母膏0.5%蛋白胨1%葡萄糖1%乳糖0.5%NaCl0.5%琼脂2%pH6.8固体培养基加琼脂2%；半固体培养基加琼脂0.75%2、酵母菌常用培养基（1）麦芽糖培养基蛋白胨1%麦芽糖2%酵母膏0.5%琼脂2%自然pH121.3℃灭菌20min。3、霉菌常用培养基PDA（马铃薯蔗糖培养基）去皮马铃薯200g切成小块，加水1000ml煮沸30min出汁，三层纱布过滤，滤液中加入2%蔗糖，补充水至终体积1000ml，加琼脂2%，自然pH。121.3℃灭菌20min。四、实验中出现的问题及讨论1、配制培养基操作过程中的问题。2、培养基灭菌操作过程中的问题。3、培养基灭菌后出现的异常现象，分析原因，讨论解决方法。实验二酸奶的酿制及乳酸菌的分离一、实验目的要求1、学习并掌握酸奶制作的基本原理和方法。2、学习并掌握从酸奶中分离和纯化乳酸菌的方法。二、基本原理酸奶是以牛乳为主要原料，接入一定量乳酸菌，经发酵后制成的一种具有较高营养价值和特殊风味的发酵乳制品饮料。通过乳酸菌发酵牛奶中的乳糖产生乳酸，当产酸到一定程度时，乳酸使牛奶中酪蛋白(约占全乳的2．9％，占乳蛋白的85％)变性凝固而使整个奶液呈第-3-页共13页凝乳状态。同时，通过发酵还可形成酸奶特有的香味和风味(与形成乙醛、丁二酮等有关)，并具有清新爽口的味觉。由于酸奶中含有乳酸菌的菌体及代谢产物，因而对肠道内的致病菌有一定的抑制作用；对人体的肠胃消化道疾病也有良好的治疗效果。三、器材1、乳酸菌种：自市售各种酸奶中分离保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus)和嗜热链球菌(Strep．tococcusthermophilus)2、培养基：（1）发酵培养基：市售鲜奶或用奶粉进行配制（2）分离乳酸菌培养基：（任选一种）培养基→平板→划线MRS分离培养基3、优质全脂奶粉（内含脂肪28%，蛋白质27%，乳糖37%，矿物质6%，水分2%），白砂糖，蒸馏水。4、酸奶发酵瓶，封口膜，保鲜膜，不锈钢锅，铁勺，塑料漏斗，无菌移液管（带棉花），脱脂棉，牙签，培养皿，恒温水浴锅，培养箱，冰箱等、温度计四、操作步骤全脂乳粉、砂糖、水混合均匀预热(60-70℃)均质(15-18MPa)灭菌(85-90℃，5-8min)冷却(43-45℃)接种分装封口菌种活化母发酵剂生产发酵剂保温发酵(42-43℃，3-6h)酸奶瓶清洗开水烫洗消毒冷藏(2～5℃)成品1、酸奶的制作⑴调配与均质按1:7（14.3g:100ml）的比例加水（水质要求：PH6.5～7.3，硬度≤10度（德国度）），在45～50℃下把奶粉配制成复原牛奶，并加入10%白砂糖及适量（0.4-3.0%）稳定剂变性淀粉（使制成的酸奶口感饱满，粘度高，抗机械剪切力强，使酸乳在输送过程中保持良好状态），高速混料，水合45～60min，防止气泡产生。或用市售鲜牛奶加5%蔗糖调匀也可。⑵装瓶在250ml的酸奶发酵瓶中装入牛奶200ml，装瓶量80%。⑶灭菌将装有牛奶的发酵瓶置于80℃恒温水浴锅中用巴氏灭菌法10磅灭菌15min，或于90℃水浴中灭菌5min。⑷冷却将已灭菌的牛奶冷却到40-45℃。⑸接种用无菌移液管以5-8%的接种量将市售酸奶接种入冷却至40-45℃的牛奶中，并充分摇匀。⑹培养把接种后的发酵瓶置于40-42℃温箱中培养4-12h。当乳酸酸度升高到0.8%，pH降低到4.2-4.4时，凝乳完全形成并有少量乳清析出，表面有小颗粒（视情况而定，培养过程中切勿摇动，以防乳块散掉，不易重结）。⑺冷藏后熟酸奶在发酵形成凝块后，取出置1-7℃的低温下冷藏12-24h，后熟，以获第-4-页共13页得酸奶的特有风味和口感。⑻品味品尝自己制作的酸奶，判断其感官品质是否达到要求，若达不到要求，分析其原因。酸奶质量的评定以品尝为标准，通常有色泽、凝块状态，表层光洁度、酸度及香味、无异味等各项指标。感官检验试验方法①色泽和组织状态：取适量试样于50mL烧杯中，在自然光下观察色泽和组织状态。②滋味和气味：取适量试样于50mL烧杯中，先闻气味，然后用温开水漱口，再品尝样品的滋味。品尝时发现有异味则可判定污染了杂菌。⑼贮存产品的贮存温度为2℃~6℃。2、酸奶中乳酸菌的分离纯化⑴倒平板培养基：将分离用培养基完全融化并冷却到45℃左右倒平板，冷凝空白培养后备用。⑵稀释：将待分离的酸奶进行适当稀释，取一定稀释度的菌液做平板分离。⑶分离纯化：乳酸菌的分离可采用新鲜酸奶进行平板涂布分离，或直接用接种环蘸取酸奶作划线分离。分离后，置于37℃下培养以获得单菌落。⑷观察菌落特征：经2-3d培养，待菌落长成后，仔细观察并区别不同类型的乳酸菌。酸奶中的各种乳酸菌在马铃薯汁牛奶培养基平板表面通常呈现三种形态特征的菌落：①扁平型菌落：大小为2-3mm，边缘不整齐，很薄，近似透明状，染色镜检为细杆菌；②半球状隆起菌落：大小为1-2mm，隆起成半球状，高约0.5mm，边缘整齐且四周可见酪蛋白水解透明圈，染色镜检为链球状；③礼帽形突起菌落：大小为1-2mm，边缘基本整齐，菌落中央呈隆起状，四周较薄，有酪蛋白透明圈，染色镜检呈链球状。⑸单菌株发酵试验：若将上述单菌落接入牛奶，经活化增殖后再以10%的接种量接入消毒后的牛奶中，分别于37℃和45℃下培养，各菌株的发酵液均可达到108个细胞/ml。若采用两种菌株混合培养，则含菌量常可倍增。⑹品尝：单株发酵成的酸奶与混菌发酵成的酸奶相比较，其香味和口感都比较差。两菌混合发酵又以球菌和杆菌等量混合接种所发酵成的酸奶为佳。杆菌→产酶→分解蛋白质→氨基酸球菌→产酸→蛋白质变性→凝结成块↓醇酯化→香味在制备酸奶时，保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌的混合物在40～50℃乳中发酵2~3h即可达到所需的凝乳状态与酸度，而任何单一菌株的发酵时间都在10h以上，其原因就是因为保加利亚乳杆菌与嗜热链球菌之间存在互生现象。保加利亚乳杆菌在发酵的初期分解酪蛋白而形成氨基酸和多肽，促进了嗜热链球菌的生长，随着嗜热链球菌的增加，酸度增加，抑制了嗜热链球菌的生长。嗜热链球菌生长过程中，乳脲活动产生CO2、甲酸刺激保加利亚乳杆菌生长。发酵的初期嗜热链球菌生长的快；发酵1小时后与保加利亚乳杆菌的比例为(3---4):1。3、感官特性应符合表1的规定。表1项目纯酸牛乳调味酸牛乳、果料乳牛乳色泽呈均匀一致的乳白色或微黄色呈均匀一致的乳白色，或调味乳、果料应有的色泽第-5-页共13页滋味和气味具有酸牛乳固有的滋味和气味具有调味酸牛乳或果料酸牛乳应有的滋味和气味组织状态组织细腻、均匀，允许有少量浮清析出；果料酸牛乳有果块或果粒4、卫生指标应符合表2的规定。表2项目纯酸牛乳调味酸牛乳果料酸牛乳苯甲酸，g/kg≤0.030.23山梨酸，g/kg不得检出≤0.23硝酸盐（以NaNO3计），mg/kg≤11.0亚硝酸盐（以NaNO2计），mg/kg≤0.2黄曲霉毒素M1，μg/kg≤0.5大肠菌群，MPN/100Ml≤90致病菌（指肠道致病菌和致病性球菌）不得检出五、实验报告1、将各批混菌发酵的酸奶品评结果记录于下表中。批次品评项目凝乳情况乳清淅出状态稀薄粘度表面气泡沫表面光泽口感酸度香味异味发粘pH结论12342、将单菌和混菌发酵的酸奶品评结果记录于下表中。单菌及混菌比例品评项目pH结论凝乳情况口感香味异味杆菌球菌杆菌:球菌（1:1）杆菌:球菌（1:4）3、在制备酸奶时，为何混菌发酵比单一菌株发酵更优越？4、双岐杆菌的乳酸发酵途径与明串珠菌的乳酸发酵途径有什么不同?实验三甜酒酿的制作和酒药中糖化菌的分离一、目的要求1、学习并掌握甜酒酿的酿制方法，了解酿酒的基本原理。第-6-页共13页2、进一步了解淀粉在糖化菌——根霉、毛霉和酵母菌作用下制成甜酒酿的过程。3、进一步掌握微生物的分离、培养等基本方法和无菌操作技术。4、加深理解根霉或毛霉的形成特征。二、基本原理甜酒酿是将糯米经过蒸煮糊化，接种后，在适宜的条件下（28-30℃），让种曲中的霉菌孢子萌发菌丝体，大量繁殖后通过酒药（根霉、毛霉和酵母菌等微生物的混合糖化发酵剂）中的根霉和毛霉等微生物所产淀粉酶的作用将原料中糊化后的淀粉糖化，将蛋白质水解成氨基酸，然后酒药中的酵母菌利用糖化产物生长繁殖，并通过酵解途径将糖转化成酒精，从而赋予甜酒酿特有的香气、风味和丰富的营养。随着发酵时间延长，甜酒酿中的糖分逐渐转化成酒精，因而糖度下降．酒度提高，故适时结束发酵是保持甜酒酿口味的关键。要初步学会和掌握酿制方法并不困难，从微生物学的观点来看，酿制的关键在于：要有优质的酒酿种曲，即种曲中应含有糖化率高的优质根霉、毛霉孢子或菌丝体；应选择优质的糯米作原料；严格无菌操作规程，尽量避免杂菌污染；合理控制酿制条件等。以糯米(或大米)经甜酒药发酵制成的甜酒酿，是我国的传统发酵食品。我国酿酒工业中的小曲酒和黄酒生产中的淋饭酒在某种程度上就是由甜酒酿发展而来的。三、实验材料酒药（根曲霉AS3.866）、糯米，马铃薯，蔗糖甜酒药中糖化菌的分离培养基：马铃薯-蔗糖-琼脂培养基蒸锅，纱布，1000ml烧杯，250ml广口培养瓶，封口膜，保鲜膜，牛皮纸，天平，培养箱，高压灭菌锅、淘米盆、防水纸、绳子、凉开水，显微镜、载玻片、盖玻片、接种环、解剖针、酒精灯、镊子、培养皿等。四、操作步骤（一）甜酒酿的制作酒药洗米蒸饭淋水降温落缸搭窝发酵甜酒酿1、浸米与洗米：选择优质新鲜糯米，淘洗干净后浸泡过夜，使米粒中的淀粉粒子吸水膨胀，便于蒸煮糊化，清水冲洗至水清亮，捞起沥干。2、隔水蒸煮：将糯米放在蒸锅内搁架的纱布上隔水蒸煮，15磅10-20min，常压30min，至米饭熟透为止。要求达到熟而不糊，外硬内软，内无夹心，疏松易散，透而不烂，均匀一致。3、淋水降温：用清洁冷水淋洗蒸熟的糯米饭，使其降温至35℃左右，同时使饭粒松散。4、接入种曲酿制：将冷却到35℃左右的米饭，按干糯米重量换算接种量，将0.4%的经粉碎的根霉曲与米饭拌匀，盛于广口培养瓶中，饭粒搭成中心下陷的喇叭形凹窝，以利于出汁，饭面均匀撒上少许曲粉，用封口膜及牛皮纸覆盖于广口培养瓶表面，用线包扎后置于30℃温箱保温培养48h即可食用。酿成的甜酒酿应是醪液清澈半透明而甜醇爽口。5、品尝（二）甜酒药中糖化菌的分离无菌操作技术，以平板划线法分离甜酒药中的糖化菌1.每组取无菌培养皿两付，先在培养皿中加入两滴5000U/mL的链霉素液，而后用已融化的马铃薯-蔗糖