α-淀粉酶

1α-淀粉酶概述摘要：α-淀粉酶(α-1,4-D-葡萄糖-葡萄糖苷水解酶)普遍分布在动物、植物和微生物中,是一种重要的淀粉水解酶。其作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1，4糖苷键，生成糊精和还原糖。由于产物的末端残基碳原子构型为α构型，故称α-淀粉酶。现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1，4糖苷键，起液化作用的一类酶。α-淀粉酶分布十分广泛，遍及微生物至高等植物。α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂，大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等，是应用最为广泛的酶制剂之一。本文概述了α-淀粉酶的发现和应用、分离纯化及结构性质、催化机制、工业化生产、应用现状与发展趋势等。关键词：α-淀粉酶生产结构性质催化机制分离纯化应用1α-淀粉酶的发现啤酒是最古老的酒精饮料，发酵是其关键步骤，其中所包含的糖化过程就是把淀粉转化为糖，这个转化过程的机理一直都没有被弄清楚。在19世纪早期，Nasse（1811年）发现，从生物体中提取的淀粉能过被转化为糖，而从被沸水杀死的植物细胞中提取的淀粉不能被转化为糖。Kirchhoff的实验发现奠定了发现谷物中一种能够将淀粉转化为糖的蛋白质的基础。Payen和Persoz（1833年）发现，发酵液的酒精析出物中含有一种对热不稳定的物质，它能使淀粉转化为糖，他们将其称为“diastase”。1886年，Lintner发现了两种淀粉酶，淀粉液化酶和淀粉糖化酶。1924年，Kuhn将淀粉水解酶归为两类。将发酵过程中能够将淀粉水解为β－淀粉酶，其能够将淀粉水解为β型麦芽糖。将能够液化和糊化淀粉的酶称为α-淀粉酶，其作用于淀粉的产物表现为低旋光性，这一点为α型麦芽糖和相关糖的特性[1]。1949年日本采用深层通风培养法生产α－淀粉酶。1959年,日本采用淀粉酶和糖化酶进行淀粉的液化和糖化,确定了酶法制造葡萄糖浆的工艺,革除了沿用100年酸水解工业,使淀粉出糖率由80%提高到100%。1973耐热性α－淀粉酶投人生产。从此淀粉酶的生产又进入了一个新阶段[2]。目前,除开展大量常规诱变育种工作外,国外已初步搞清了α一淀粉酶的调控基因,探讨了有关转导转化和基因克隆等育种技术。将枯草芽抱杆菌重组体的基因引入生产菌株阴,使α-淀粉酶产量提高7-10倍,并已应用于食品和制酒工业,给选育高产α-淀粉酶菌株开创了新的途径[3]。α-淀粉酶在动物、植物、微生物中均能产生，但大量生产还是主要靠微生物发酵。世界许多国家都以枯草杆菌生产的细菌淀粉酶和米曲霉生产的真菌淀粉酶为主要产品[4]。2α-淀粉酶的催化机制、空间结构和性质2.1α-淀粉酶的催化机制McCarter、Davies提出α-淀粉酶的催化过程包括三步，共发生2次置换反应。第一步，底物某个糖残基要先结合在酶活性部位的亚结合位点；第二步，亚结合位点的另一个亲核氨基酸对糖残基的C1碳原子进行亲核攻击，与底物形成共价中间产物，同时断裂C1-OR键，置换出底物的糖基配基部分；第三步，糖基配基离去之后，水分子被激活，这个水分子再将ASP的亲核氧与糖残基的C1之间的共价键C1-ASP水解掉，置换出酶分子的ASP残基，水解反应完成。在第二次置换反应中，如果进攻残基不是2水分子，而是一个带有游离羟基的糖（寡糖）ROH，那么酶分子的ASP残基被置换出去后，就发生了糖基转移反应而非水解反应[5]。2.2α-淀粉酶的空间结构α-淀粉酶是由478个氨基酸残基组成，它们折叠在三级结构的两大区域。其中，最初的380个残基组成了区域A，剩余的组成了区域B。区域A包括一个（βα）8的超二级结构。在（βα）8的超二级结构中，α螺旋和β折叠的空间分布与磷酸丙糖异构酶、丙酮酸激酶或醛缩酶类似。区域B是由8条反向平行的β-片层组成。这两个区域由一条单链多肽连接着。该多肽链有广阔的结合部位，该部位主要是由疏水残基组成。一个较大的裂缝位于区域A平行的β-barrel的羧基末端。一个由共价键相连的碳水化合物基团在电子密度图中被发现，其是作为ASN197的大支链。在裂缝周围隐匿着一个电子密度孤峰，这是由钙离子产生的。钙离子被周围的残基连接，起到稳定裂缝结构的作用[6]。2.3α-淀粉酶的性质2.3.1底物特异性α-淀粉酶显示出对淀粉及其衍生物有最高的特异性，这些淀粉及衍生物包括支链淀粉、直链淀粉、环糊精、糖原质和麦芽三糖等。2.3.2最适pH和最适温度通常情况下真菌和细菌类α-淀粉酶的最适pH在酸性和中性范围内，如芽孢杆菌α-淀粉酶的最适pH为3，碱性α-淀粉酶的最适pH在9～12。另外，温度和钙离子对一些α-淀粉酶的最适pH有一定的影响，会改变其最适作用范围。不同微生物来源的仅一淀粉酶的最适作用温度存在着较大差异，其中最适作用温度最低的只有25℃～30℃，而最高的能达到100℃～130℃。2.3.3金属离子α-淀粉酶是金属酶，很多金属离子，特别是重金属离子对其有抑制作用；另外，巯基，N-溴琥珀酸亚胺，p-羟基汞苯甲酸，碘乙酸，BSA，EDTA和EGTA等对α-淀粉酶也有抑制作用。α-淀粉酶中至少包含一个Ca2+，Ca2+使酶分子保持适当的构象，从而维持其最大的活性和稳定性。Ca2+对仅一淀粉酶的亲和能力比其它离子强，通常情况下结合一个Ca2+就足以使α-淀粉酶很稳定。用EDTA透析或者用电渗析可以将Ca2+从淀粉酶中除去，加入Ca2+可以激活钙游离酶。也有报道α-淀粉酶在Ca2+存在时会失活，而经EDTA处理后却保留活性，另外，有报道称Ca2+对α-淀粉酶没有影响[7]。2.3.4电场强度实验结果表明，不同强度电场导致酶活性增加的效应不同，并且呈非单调性变化。电场能量虽然不足以改变酶蛋白氨基酸序列，但可以改变酶蛋白的构象．姚占全等[8]用不同强度电场处理α-淀粉酶5min，表明电场对酶的影响经过一定时间后趋于消失。3.α-淀粉酶的分离纯化高纯度α－淀粉酶是一种重要的水解淀粉类酶制剂，分离纯化α－淀粉酶的方法很多，一般都是依据酶分子的大小、形状、电荷性质、溶解度、稳定性、专一性结合位点等性质建立的。要得到高纯度α－淀粉酶，往往需要将各种方法联合使用。通过超滤、浓缩、脱盐和聚丙烯酰胺垂直板凝胶电泳，对利用基因工程菌生产的重组超耐热3耐酸性α一淀粉酶进行纯化，得到电泳纯级的超耐热耐酸α-淀粉酶，纯化倍数为11.7，活力回收率为29.8%[9]。但上述方法存在的共同问题是，连续操作和规模放大都比较困难。反胶团萃取具有选择性高、正萃与反萃可同时进行、分离与浓缩同步进行、操作简单和易于放大等优点，并能有效防止生物分子变性失活[10]。以CTAB/正丁醇/异辛烷构成反胶团系统,通过反胶团萃取方式纯化精制α-淀粉酶。最佳反应条件为:萃取温度40℃,水相组成为NaCl0.03mol/L,pH12.0,有机相：无机相=1：2,振荡时间10min;反萃取最佳条件为:温度60℃，水相组成为KCl3mol/L,pH4.0,有机相：无机相=2：1,反萃取振荡时间10min。在上述条件下,经过一个萃取与反萃取循环后,淀粉酶的萃取率最高可达90.78%[11]。双水相技术具有处理容量大、能耗低、易连续化操作和工程放大等优点。应用双水相系统PEG／磷酸盐分离纯化α－淀粉酶，增加PEG浓度有助于酶富集上相。同样用PEG／磷酸盐双水相体系从发酵液中直接萃取分离低温α一淀粉酶，分配系数及回收率分别为4.8和87％[12]。采用PEG(聚乙二醇)／硫酸铵双水相体系，由PEG和硫酸铵所组成的双水相体系，对α－淀粉酶的回收率可达94.84％，分配系数可达17.10[13]。双水相技术有着溶液粘度高、分相时间长，易造成界面乳化等缺点，给实际操作带来很多问题。软基质色谱介质分离纯化α-淀粉酶的粗酶提取液，缺点是机械强度小,受压易变形,分析速度慢,分离效率低,柱寿命短,固定相对PH、离子强度和压力非常敏感,反复使用时配体碎片容易脱落。硬基质色谱应用方面,李华儒等首次合成一种对α一淀粉酶具有特异亲和能力的色谱介质,并成功地分离纯化了工业粗酶,获得了高纯度产品,其活性回收率88%，此法的研究成功为大规模制备高纯度α一淀粉酶提供了一个新工艺路线[14]。4α-淀粉酶的应用4.1面包焙烤工业，作为保鲜剂麦芽α－淀粉酶和微生物α－淀粉酶被广泛用于焙烤工业，这些酶用于面包工业，使这些产品体积更大、颜色更好、颗粒更柔软。真菌α-淀粉酶可水解面粉中的受损淀粉生成小分子糊精，通过酵母的进一步发酵产生醇类物质和二氧化碳，从而使面包体积增大[15]。在此过程中产生的还原糖在面包烘焙过程中可参与美拉德反应，有助于改善面包的外表色泽。4.2淀粉的液化和糖化作用α－淀粉酶的主要市场是淀粉水解的产物，如葡萄糖和果糖。淀粉被转化为高果糖玉米糖浆(HFCS)。由于他们的高甜度，被用于饮料工业中软饮料的甜味剂。这个液化过程就用到在高温下热稳定性好的α－淀粉酶。α－淀粉酶在淀粉液化上的应用工艺已经相当成熟，而且有很多相关报道。目前，欧美各国大多采用真菌α-淀粉酶作为糖化剂生产高麦芽糖浆，其麦芽糖含量超过70%，甚至更高[16]。4.3在啤酒酿造中的应用啤洒是最早用酶的酿造产品之一，在啤洒酿造中添加α-淀粉酶使其较快液化以取代一部分麦芽，使辅料增加，成本降低，特别在麦芽糖化力低，辅助原料使用比例较4大的场合，使用α-淀粉酶和β-淀粉酶协同麦芽糖化，可以弥补麦芽酶系不足，增加可发酵糖含量，提高麦汁率，麦汁色泽降低，过滤速度加快，提高了浸出物得率，同时又缩短了整体糊化时间。4.4淀粉脱浆现代纤维制造工艺在编织过程中会在纱线中产生大量的细菌，为防止这些纱线断裂，往往会在纱线的表面加一层可去除的保护层。这些表面层的材料有很多种，淀粉是非常好的一个选择。因为它便宜、容易获取，并且可以很容易去除。淀粉脱浆可以利用α-淀粉酶，它能有选择性的去除淀粉浆而不伤害纱线纤维，还能随机的使淀粉降解为易溶于水的糊精，因而容易被洗掉。4.5造纸中改变粘度淀粉酶在造纸工业中的用途主要是改良纸张涂层淀粉。不同的纸张施胶，对淀粉分子量、粘度有不同的要求。粘度太高，不利于淀粉很好地均布铺展。通过水解成为短链分子，可以降低淀粉的粘度。一种方法是稀酸水解，二是用α-淀粉酶水解[17]。相比而言，酶的催化速率高，应用少量即可达到效果；同时其为生物活性物质，不会产生污染。4.6除垢剂中的使用酶是现代高效除垢剂的成分之一。现在两家主要除垢剂酶的生产厂家诺维信和杰能科已经利用蛋白质工艺改善淀粉酶的漂白稳定性。他们用亮氨酸替代地衣芽孢杆菌α-淀粉酶蛋白第197位上的蛋氨酸，导致酶对氧化剂成分的抵抗能力大大增强，提高了其氧化稳定性，使酶在储存过程中的稳定性更好。并已经在市场上推出了这些新产品[18]。4.7医药行业中的应用在医药行业，为了弥补乳酸脱氢酶(LDH)、α-淀粉酶(α-Amy)、癌胚抗原(CEA)各单项检查在卵巢血清学诊断中灵敏度较低的不足，对三者进行了联合检测，以其中任意两项为联检阳性，均可提高卵巢癌的阳性检出率。研究唾液α一淀粉酶与致龋血链球菌粘附的关系，为龋病的病因学研究和预防提供了理论依据[12,19]。黑曲霉α-淀粉酶因具有耐酸性，适用于制造助消化的药物，开发适合于胃酸性环境(pH2.0左右)的耐酸性α-淀粉酶，用于制备消化助剂，将会使医疗效果更为有效[12,20]。5小结通过对α-淀粉酶的学习可以看到，现如今α-淀粉酶已经被研究的很透彻了，其空间结构、蛋白质序列、催化机制等等都应经被发现。而对于工业化应用，由于对于不同的环境对酶的要求不同，现如今普通的α-淀粉酶适用的范围比较窄，主要应用的是耐高低温、耐酸碱的α-淀粉酶。但是由于技术水平的限制，我国的α-淀粉酶的活性相比较国外较低，因此必须加强该菌种选育的水平，获得产酶活性更高的菌株。参考文献5[1]Meng-MinHong.TheDiscoveryofAmylase.Discoveriesinplantbiology.第一卷:215-232[2]刘春莉，张文学，杨瑞，特殊α一淀粉酶的应用研究现状和前景展望[J].四川食品与发酵，2002(2