proteomics蛋白质组学

proteomics1.translationalanalysis:proteomics1.1蛋白质组学绪论1.1.1.什么是蛋白质蛋白质组“Proteome”一词源于“PROTEin”与“genOME”的杂合.是指“由一个基因组所表达的全套蛋白质。”蛋白质组学Proteomics：是以蛋白质组为研究对象，从整体水平上分析一个有机体、细胞或组织的蛋白质组成及其活动规律的科学。1.1.2.蛋白质组学的产生基因组学的局限性：(1).一个基因并不止存在一个相应的蛋白质人类约有2万5千个基因，却有1百万种蛋白分子(2).mRNA的表达丰度与蛋白质丰度相关性并不好。mRNA的表达水平不能完全反映蛋白质的表达水平（3）.蛋白质组能动态反映生物系统所处的状态细胞周期的特定时期；分化的不同阶段；对应的生长和营养状况、温度、应激和病理状态因此，蛋白质是生理功能的执行者，是生命现象的直接体现着，对蛋白质结构和功能的研究将直接阐明生命在生理或病理条件下的变化机制。1.1.3.蛋白质组学的主要研究内容蛋白质表达时空、蛋白质翻译后修饰、蛋白相互作用、蛋白质的分离与鉴定、蛋白质功能、药物靶分子。1.1.4蛋白质组学研究的技术方法表达蛋白质组学、功能蛋白质组学、蛋白质组生物信息学、结构蛋白质组学1.表达蛋白质组学：1.蛋白质提取技术：一步法、分布提取法2.蛋白质分离技术:一维电泳分离技术（SDS-PAGE）双向电泳技术（2-DE）荧光差异显示凝胶电泳（DIGE）毛细管电泳色谱分离技术…3.蛋白质鉴定技术：蛋白质N端测序（Edman降解法）、质谱技术2功能蛋白质组学：1.生物信息学分析：2.全基因组的蛋白质标签3.基因敲除或删除4.酵母双杂交5.蛋白质芯片6.蛋白质翻译后修饰1.2双向电泳技术1.2.1双向电泳技术的原理原理：根据蛋白质的两个一级属性：等电点和相对分子量的特异性，将蛋白质混合物在第一个方向上按照等电点高低进行分离（等点聚焦），在第二个方向上按照分子质量大小进行分离(SDS-PAGE)。第一向：等电聚焦第二向：SDS-PAGE1.2.2双向电泳的操作流程1.样品制备2.固相预制胶条的水化。3.第一向等电聚焦4.胶条的平衡5.从第一向转移到第二向6.第二向SDS-PAGE电泳7.凝胶的染色及检测8.图像分析1.2.3双向电泳存在的问题低丰度蛋白的检测检测的蛋白质点数不能包括细胞内所表达的所有蛋白极酸和极碱性区蛋白的分离高分子质量区蛋白的分离（100kDa的蛋白很难进入胶条）膜蛋白的提取和有效分离需要一种真正高通量的胶上蛋白鉴定技术1.3质谱技术1.3.1质谱的概念质谱（MassSpectrometry）是将样品分子转化为运动的气态离子并按质荷比(M／Z)大小的差异来分离并检测离子的相对分子质量。m/z15294357859911314271所得结果以图谱表达-质谱图（MassSpectrum）质谱能够提供的信息⑴相对分子质量⑵分子式(样品的元素组成)⑶鉴定某些官能团⑷分子结构信息⑸人机问答，给出可能的化合物1.3.2质谱的原理质谱用于结构分析有点像：花瓶打碎碎片(不可看到它的形状和质地)(可以看到它的形状和质地)将碎片拼起来复原后的花瓶1.3.3质谱的组成（1）离子源将进样系统引入的气态样品分子转化成离子。离子源是质谱仪的心脏。不同分子离子化所需要的能量差异很大，应选择不同的离解方法软电离方法能量的较低电离方法，适用于易破裂或易电离样品硬电离方法能量较高的电离方法包括：（1）电喷雾源ESI（2）基质辅助激光解析MALDI（2）质量分析器将离子源中生成的各种正离子按质荷比m／z分离。质量分析器的主要类型有：（1）磁分析器（2）飞行时间分析器（3）四级杆分析器（4）离子捕获分析器（5）离子回旋共振分析器1.3.4蛋白质的鉴定：1.肽质量指纹图谱,PMF肽质量指纹图谱(Peptidemassfingerprinting,PMF)指蛋白质被酶切位点专一的蛋白酶水解后得到的肽片段质量图谱.根据PMF检索数据库即可进行蛋白质的鉴定2.肽序列标签，PST肽序列标签(Peptidesequencetag,PST):数据库检索鉴定蛋白质时,可读出的部分氨基酸序列结合此段序列前后的离子质量和肽段母离子质量,在数据库中查询的方法,或者直接用串联质谱数据进行检索.2.蛋白质的相互作用研究的重要性蛋白质之间相互作用以及通过相互作用而形成的蛋白复合物是细胞各种基本功能的主要完成者。几乎所有的重要生命活动，包括DNA的复制与转录、蛋白质的合成与分泌、信号转导和代谢等等，都离不开蛋白质之间的相互作用。2.研究蛋白质相互作用的常用方法酵母双杂交（yeasttwohybridization）亲和层析免疫共沉淀蛋白质交联基于GFP的细胞内蛋白质相互作用的研究方法噬菌体显示系统筛选（phagedisplaylibraries）2.1.1酵母双杂交系统简介酵母双杂交系统是在真核模式生物酵母中进行的，研究活细胞内蛋白质相互作用，对蛋白质之间微弱的、瞬间的作用也能通过报告基因的表达产物敏感地检测得到。它是一种具有很高灵敏度的研究蛋白质之间关系的技术。该技术既可用来研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，也可用来研究高等植物基因组编码的蛋白质之间的相互作用。1989年美国纽约州立大学的Fields和Song首先描述了酵母双杂交系统(yeasttwo-hybridsystem)。该系统的建立是基于对真核生物调控转录起始过程的认识。真核生物基因转录需要反式转录激活因子的参与，真核生长转录因子含有两个不同的结构域：这两个结构域各具功能，互不影响,单独存在时没有转录激活的功能，只有两者通过共价或非共价键连接建立起来的空间结构方可表现出一个完整的激活特定基因表达的激活因子的功能。2.1.2酵母双杂交系统的原理噬菌体展示技术（PhageDisplaytechniques，PDT）起源于1985年,是一种用于筛选和改转录激活因子DNA结合结构域(BD)(DNAbindingdomain)转录激活结构域(AD)(activationdomain)造功能性多肽、蛋白质强有力的生物技术，广泛应用于蛋白组学、基因克隆等多个分子生物学领域。目前噬菌体展示技术的研究进展非常迅速，在抗原决定簇的定位、蛋白质相互作用位点的确定、特异调节分子的分离和人工抗体和疫苗的制备、诊断技术、酶抑制剂的研究开发、多肽药物的研制等生物技术研究的不同领域得到了应用，并对这些领域产生了深远的影响。2.2.2噬菌体展示原理在噬菌体衣壳蛋白基因中插入外源基因，形成融合蛋白表达在噬菌体颗粒蛋白的表面，被展示的多肽或蛋白质可保持相对独立的空间结构和生物学活性。利用靶分子，采用适当的淘洗方法（亲和→洗脱→扩增→亲和的循环步骤），洗去非特异结合的噬菌体，最终从噬菌体文库中筛选出能结合靶分子的目的噬菌体；外源多肽或蛋白质表达在噬菌体的表面，而其编码基因作为病毒基因组中的一部分可通过噬菌体DNA序列测序出来，使得表达蛋白（表现型）和编码基因（基因型）之间完美地结合起来，为生物科学提供高效而实用的研究手段。