ΔNp73基因对大肠癌对大肠癌血管生成影响的实验研究

ΔNp73基因对大肠癌对大肠癌血管生成影响的实验研究吴红涛成都军区四十四医院内一科贵州贵阳550009【摘要】目的：探讨ΔNp73基因、血管内皮生长因子(VEGF)表达和大肠癌血管生成的关系。方法：本研究通过将外源性的ΔNp73以基因转染的方式在大肠癌细胞中诱导其过表达，通过观察转染前后VEGF表达及MVD的改变。检索近年来研究生长抑素治疗炎症性肠病的临床证据的文献，进行评价。结果：我们认为ΔNp73基因可促进VEGF的过度表达,并与VEGF协同作用，使MVD增加,进而加速了大肠癌血管的生成。结论：研究ΔNp73基因与VEGF表达或肿瘤内MVD，将有助于筛选需要辅助治疗的大肠癌患者并指导用药，也有助于抗肿瘤药物的研究和开发。【关键词】ΔNp73基因大肠癌VEGF肿瘤血管生成在肿瘤发生、发展和转移过程中有重要作用,许多研究发现,癌基因和抑癌基因的改变可直接调控血管生成因子和血管抑制生成因子,导致血管增生。近年来研究显示,ΔNp73基因与多种肿瘤的侵袭转移相关，可能是肿瘤进展和预后的一种标志。但有关ΔNp73基因与大肠癌的血管生成的影响研究报道较少，并且大多从组织病理学和统计学分析的角度进行。本研究通过将外源性的ΔNp73以基因转染的方式在大肠癌细胞中诱导其过表达，通过观察转染前后VEGF表达及MVD的改变，旨在探讨ΔNp73基因、血管内皮生长因子(VEGF)表达和大肠癌血管生成的关系，以期为临床研究大肠癌转移和防治研究提供理论和实验论据。材料和方法1材料①LOVO细胞株及真核表达质粒pCDNA3-ΔNp73均由第三军医大学大坪医院肿瘤科惠赠。RPMI-1640培养基、小牛血清购自Hycolone公司,胰蛋白酶购自Sigma公司脂质体DOTAP(liposomal)和G418购自Roche公司,AMV-RTase、Taq酶、Oligo(dT)15、dNTP购自Promega公司,SP免疫组化试剂盒、兔抗人VEGF单克隆抗体购自北京中山公司,RIPA蛋白提取试剂盒购自上海申能博彩公司。④AMV-RTase、Taq酶、Oli(dT)15购自Promega公司。⑤PCR引物由上海申友公司合成。⑤健康纯种SPF级BALB/cA-nu裸鼠10只，购自本院实验动物研究所，雌雄不限，4－5周龄，体重20＋2g，在第三军医大学大坪医动物研究所SPF级动物室饲养。2LOVO-ΔNp73细胞株的建立方法参见文献[1]进行。培养细胞浓度至1x107后准备提取总RNA和蛋白。3RT-PCR法检测VEGF表达按Tripure试剂盒说明提取细胞总RNA,紫外分光光度计定量,RNA(g/L)=A260×40×稀释倍数/1000。AMV-RTase和Oligo(dT)15引物将总RNA反转录成cDNA。取5μl反转录cDNA作PCR扩增,反应体系为25μl,含10×PCRbuffer2μl,KCL10mmol/l,MgSO42mmol/L,dNTP各200μmol/L,TaqDNA聚合酶0.5U,上下游引物各0.3μmol/L。按以下参数在PCR扩增仪(Perkin-Elmer公司9600型)上进行。VEGF反应条件:94℃变性70s,60℃退火60s,72℃延伸90s,经33个循环周期后,产物经1%琼脂糖凝胶电泳。β-actin反应条件:94℃变性65s,60℃退火70s,72℃延伸110s,经30个循环周期后,1%琼脂糖凝胶电泳。以Gel-PROANALYZER凝胶定量分析软件分析凝胶电泳结果,得出各条带的积分光密度(Integralopticaldensity,IOD),以同时扩增的β-actin为内参对照,计算目的条带和β-actinIOD比值即标准化积分光密度值(normalizedintegratedintensity,NII),以NII%为单位,代表VEGFmRNA表达水平。4Western-blot检测VEGF蛋白按照RIPA蛋白提取试剂盒的步骤提取细胞总蛋白,采用Bradford法测定总蛋白浓度。取总蛋白40μg行SDS-PAGE,电泳结束后电转印17h至PVDF膜,膜封闭液(1%BSA、0.02mol/L)内封闭室温1h,4℃过夜,PBS洗膜5min×4,加入兔抗人VEGF单克隆抗体(1∶350),37℃孵育1h,PBS洗膜5min×4,再加入羊抗兔IgG(1∶2000),37℃孵育1h,PBS洗膜5min×4,化学发光试剂与PVDF膜共同孵育1min,将PVDF膜与X光片共同放暗盒曝光4min,显影3min,定影10min。以Gel-PROANALYZER凝胶定量分析软件分析Western-blot检测结果,得出各条带的灰度值,以平均灰度值代表VEGF蛋白表达水平。5ΔNp73基因对大肠癌血管生成影响体内实验①裸鼠种植瘤模型的建立将10只裸鼠随机分为2组，每组5只，第一组接种LOVO细胞，第二组接种过表达ΔNp73基因的LOVO细胞（LOVO-ΔNp73细胞）。70％酒精消毒裸鼠背部皮肤，细胞悬液摇匀后，用带6号针头的一次性注射器抽取瘤细胞悬液0.3ml，含1x107个瘤细胞，接种于裸鼠皮下，一周后复种一次。接种瘤细胞后，将裸鼠送回SPF级饲养室，定期观察小鼠精神、饮食及排便等情况，称量小鼠体重。接种一周后裸鼠皮下出现米粒大笑的红色硬结，即为种植瘤的生长。成瘤一月后颈椎脱臼法处死裸鼠。取下肿瘤称重。肿瘤组织置于10％中性福尔马林浸泡，常规石腊包埋后，切片，厚5cm，行常规HE染色，普通光学显微镜观察。②裸鼠种植瘤VEGF免疫组化检测标本切片厚度为5um，60OC烤箱加热24h，脱腊，梯度酒精水化。0.3%H2O2室温封闭10min，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5min。0.2％胰蛋白酶消化5min。PBS冲洗，5minx3次。5％正常山羊血清室温封闭10min。倾去血清，加一滴一抗工作液，湿盒内4OC过夜。PBS冲洗，5minx3次。滴加生物素标记的二抗（1：100稀释），37OC孵育，30min。PBS冲洗，5minx3次。滴加辣根酶标记链霉卵蛋白素，（1：100稀释）,37OC孵育30min。PBS冲洗，5minx3次。DAB显色，镜下观察，自来水冲洗终止显色反映。苏木素复染15-30s，盐酸酒精还原，饱和碳酸锂分化校色，梯度酒精脱水，二甲苯透明后封片。普通光镜观察，显微摄影记录。③肿瘤组织微血管密度(MVD)测定MVD计数参考Weidner等[2]方法,先在低倍镜下扫视整个组织切片,在肿瘤浸润区选择内皮细胞染色清晰、背景良好、微血管最密集的4个视野里,然后在高倍镜视野范围内计数所有染色的微血管,取4个视野的计数结果均数为该切片的微血管数。6统计学处理数据结果以均数±标准差(x±s)表示,采用t检验,SPSS10.0统计学软件进行分析。结果2.1VEGFRT-PCR结果结果见图1。转染了pcDNA3后VEGFmRNA表达水平与转染前无显著性差异(P0.05),而转染了ΔNp73能使A549细胞及LOVO细胞中VEGFmRNA表达水平增高,与未转染ΔNp73基因的细胞相比较有显著性差异(P0.05),见表1。图1VEGF和β-actin的RT-PCR结果表1转染ΔNp73基因前后LOVO细胞中VEGFmRNA表达水平（NII，x±s）（n＝5）对照组pcDNA3ΔNΔNp7329＋1333＋1138＋9**P0.052VEGF蛋白Western-blot结果VEGF蛋白表达Western-blot检测结果见图3。转染pcDNA3后LOVO细胞中VEGF蛋白表达水平与转染前无显著性差异(P0.05),而转染ΔNp73能使VEGF蛋白表达水平升高,与未转染ΔNp73基因的细胞相比有显著性差异(P0.05)。（表2）表2转染ΔNΔNp73前后LOVO细胞中VEGF蛋白含量（平均灰度值，x±s）对照组pcDNA3ΔNΔNp73平均灰度值294＋61263＋79322＋46*注:*为p0.01，同对照组相比图2VEGF蛋白表达Western-blot检测结果1对照组2转染空载体pcDNA733转染ΔNp73组3裸鼠种植瘤中的VEGF表达情况接种肿瘤细胞并且复种后，裸鼠全部成瘤。在SPF级条件下饲养，裸鼠无死亡。平均出瘤时间为6.7+2.6天，随着瘤龄增长肿瘤体积明显增大。成瘤4周后，颈椎脱臼法处死裸鼠，于种植瘤取材，制成切片。裸鼠种植瘤HE染色后光镜下观察，可见在肿瘤的边缘有较完整的假性包膜，假性包膜的外面有较多的小血管，其中有一部分穿过假性包膜向肿瘤内部延伸，瘤体的血管大多数位于肿瘤边缘。肿瘤细胞呈多边形，排列紊乱，细胞核大而深染，形状不规则，染色质颗粒粗大，着色深，核浆比例大，核分裂像多，并且可见病理核分裂像。肿瘤中心几乎没有血管，有大片坏死区，并有淋巴细胞浸润。裸鼠种植瘤中VEGF主要表达于细胞浆，呈棕黄色颗粒染色(DAB显色)，.根据染色细胞数判定其表达强弱；结果发现接种LOVO-ΔNp73细胞的种植瘤中VEGF蛋白表达相比对照组增高。4裸鼠种植瘤MVD测定结果所有肿瘤组织内MVD均阳性表达,内皮细胞被染成棕黄色(图5)。LOVO-ΔNp73细胞组与对照组相比MVD显著增加(P0.01)(表3)表3裸鼠种植瘤中MVD比较（x±s，n＝25）分组MVDpLOVO细胞8.17＋1.26LOVO-ΔNp73细胞12.69＋1.970.01讨论肿瘤的血管生成(angiogenesis)是指从已存在的小血管基础上形成新血管的过程,是实体瘤生长和转移的基础，这些血管为肿瘤提供养料和排泄代谢产物,也为肿瘤细胞转移提供了良好的机会。血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)与血管生长抑制因子之间的动态平衡,精确控制着肿瘤生长和恶化过程中所需的新生血管形成。在肿瘤发生早期生成新生血管且血管表型的转化是恶性标志。许多基因通过调控血管调节因子来调节肿瘤的血管生成[3]。Sun等人[4]研究发现,在许多肿瘤中普遍存在ΔNp73mRNA和ΔNP73蛋白的高表达，并推测ΔNp73基因对肿瘤血管生成起着潜在的促进作用。VEGF作为一种最重要的血管生长因子在血管生成中起中心作用,目前已经证明VEGF与多种肿瘤的血管生成、肿瘤增长及转移有关[5]。本研究通过基因转染的方式,在人类大肠癌细胞中诱导ΔNp73基因的高表达,以RT-PCR半定量方法研究转染ΔNp73基因后大肠癌细胞中VEGF表达水平的变化,结果发现：转染ΔNp73基因的LOVO细胞中VEGF的表达较对照组明显增高，免疫组化结果显示从正常组织到肿瘤组织,转染ΔNP73基因后的LOVO细胞中VEGF表达的阳性率和强度都显著升高。因此，我们认为ΔNp73的表达与肿瘤血管生成有显著的相关性：即高表达ΔNp73基因能够上调大肠癌细胞中VEGFmRNA的表达。本实验还对裸鼠种植瘤的瘤内微血管密度（MVD）进行了检测。MVD被认为是影响患者生存的独立预后因素,可作为评价肿瘤血管生成的较好指标[6]。由本实验测定的结果可以看到，在裸鼠种植瘤中，ΔNp73的高表达与MVD的表达呈正相关，即ΔNp73增加了裸鼠种植瘤的MVD(p0.01)，二者的表达具有一致性，可以将此结果作为ΔNp73基因与肿瘤血管生成密切相关的一个强有力的佐证。在血管发生中,VEGF促进血管生成,而MVD最能代表血管生成的强度，因此，结合VEGF表达测定的结果，我们认为ΔNp73基因可促进VEGF的过度表达,并与VEGF协同作用，使MVD增加,进而加速了大肠癌血管的生成。推测其可能的机制为：(1)ΔNp73基因通过增强VEGF启动子来促进大肠癌细胞表达VEGF，因而促进了大肠癌血管的生成。(2)减少了凝血栓蛋白(thrombospontin,TSP-1)或增强蛋白激酶C的活性，使VEGF的表达量增加，促进肿瘤新生血管的形成。(3)有实验研究表明ΔNp73抑制大肠癌细胞凋亡的实验结果，推测高表达ΔNp73基因能够上调VEGFmRNA的表达的作用可能是通过抑制肿瘤细胞凋亡来实现的。目前血管