HER2基因真核表达载体的构建及其抑瘤效应研究

HER2基因真核表达载体的构建及其抑瘤效应研究贺丽清张存李维娜张路张英起(第四军医大学生物技术中心，陕西西安710033)【摘要】目的构建HER2基因真核表达载体，研究其对肿瘤生长的抑制作用。方法通过RT-PCR方法从HER-2+SKBR3细胞株中获得HER-2基因胞外段编码区cDNA，构建pRC-CMV-信号肽-hHER2-ECD真核载体，于大肠杆菌DH5α中进行扩增；用获得的质粒免疫小鼠，ELISA法和ELISPOT法分别检测体液及细胞免疫情况，然后用EMT-6细胞接种肿瘤，观察肿瘤生长情况。结果构建的pRC-CMV-信号肽-hHER2-ECD真核载体经酶切和DNA测序分析，结果表明该基因的序列与设计的序列完全相同。pRC-CMV-信号肽-HER2真核表达质粒转染细胞后，目的基因在mRNA水平的表达与预期结果一致。获得的质粒能够引起较低的体液免疫，但其可诱导较高的T细胞反应，并且可明显降低小鼠成瘤率。结论构建的HER2基因真核表达载体可在细胞中表达且对小鼠实体瘤的生长具有一定的抑制作用。【关键词】真核表达载体HER2转染肿瘤ConstructionandantitumoreffectofHER2DNAeukaryoticexpressionvectorHeli-qingZhangcun（Thedepartmentofbiotechnologycenter，TheFourthMilitaryMedicalUniversity，Xi’an710033，China）【Abstract】AIM:ToconstructaneukaryoticexpressingvectorofHER2andinvestigatetheinhibitoryeffectonthegrowthoftumorbytheexpressionoftheplasmidinvivo．．Methods：ThecDNAofHER2extracellulardomainwaspreparedthroughRT-PCRfromHER-2+SKBRcellline,thenitwasclonedintopRC-CMVvectorandDH5α,theimmunocompetenceoftheplasmidwasstudybyELISAandELISPOT.IncubatedmicewithEMT-6andthetumorgrowthwasobserved.RESULTS:DNAsequencingandrestrictionenzymedigestionprovedthatHER-2genewascorrectlyconnected.AftertransfectionwithplasmidpRC-CMV-signalpeptide-HER2,293cellscouldproduceHER2mRNA.TheplasmidcaninducelowimmunebuthighTcellresponseanditcanrestrainthegrowthoftumorobviously.CONCLUSION:P1asmidcanexpressincells,TheplasmidCaninhibitthegrowthofsolidtumor．【Keywords】eukaryoticexpressingvector;HER-2;transfection;tumorHER2/neu基因编码分子量为185kDa的受体酪氨酸激酶HER2/neu蛋白，它与细胞恶性转化有关，是癌症病因学中的一种生物学相关蛋白。大量的疫苗研究表明，HER-2全长并不能诱导有效的免疫反应，而胞外区的近膜端免疫原性较强[1]。故本实验首先截取HER-2胞外区的近膜区构建了rhHER-2-ECD真核表达载体，为进行肿瘤疫苗的功能研究奠定基础。1主要试剂材料1。1细菌菌种、细胞株及实验动物E．coliDH5本室保存。质粒pRC-CMV为真核表达载体，第四军医大学生化教研室馈赠。HER-2/neu+EMT6细胞株、SKBR3细胞株、HEK293细胞株由本室保存。6－8周BALB/c小鼠，雌性，由第四军医大学实验动物中心提供。1。2分子生物学试剂质粒纯化试剂盒与核酸片段纯化试剂盒购自上海博亚公司，寡核苷酸片段由北京澳科公司合成。限制性核酸内切酶BamHI，HindⅢ，XbaI等均购自TaKaRa公司。T4DNA连接酶，TaqDNA聚合酶购自TaKaRa公司。TaqDNA聚合酶（PCRmix），DNAMarker购自天根公司。1640培养基为Gibco公司产品。小牛血清为杭州四季青生物工程材料研究所产品。HER-2/Fc蛋白购自R&D公司。HRP标记的羊抗小鼠IgG和FITC标记的羊抗小鼠IgG购自中杉生物工程公司。ELISPOT试剂盒购自MABTECH公司。LipofectamineTM2000脂质体购自R&D公司，PVDF膜的96孔板购自Millipor公司。2实验方法2。1引物设计参考GeneBank中人HER2基因序列（gi:54792095），由于HER2胞外区太长，所以根据文献[2]，截取近胞膜端抗原性较强的一段序列，设计一对引物，据克隆所需在每条引物的5’端引入相应的限制性内切酶识别序列及保护碱基，经计算机软件分析，由北京奥科生物公司合成，引物序列如下（下划线序列分别为引入的BamHI，XbaI酶切位点）:P1:5’CGGGATCCTGCCACCAGCTGTGCGCCP2:5’GCTCTAGATCAGTTGATGGGGCAAGGCT2。2信号肽序列的设计真核载体表达的靶分子分泌到细胞外，必须有信号肽的协助。选取分泌性较强的人Ig的信号肽（MKHLWFFLLLVAAPRWVLS），碱基序列由北京奥科生物公司合成，引入相应的酶切位点HindⅢ，BamHI：1--5’AGCTTATGAAACATCTGTGGTTCTTCCTTCTCCTGGTGGCAGCTCCCAGATGGGTCCTGTCCG2--5’GATCCGGACAGGACCCATCTGGGAGCTGCCACCAGGAGAAGGAAGAACCACAGATGTTTCATA2。3HER2胞外区片段cDNA的获得（RT-PCR）本室常规法从HER-2+的人乳腺癌细胞株SKBR3中提取细胞总RNA，取5µL测A260/280值。反转录出hHER2胞外区片段cDNA，以反转录产物为模板用上述引物进行PCR扩增，扩增条件是:94℃变性30s，60℃退火30s，72℃延伸1min，循环30次，最后72℃延伸10min。2。4pRC-CMV-信号肽载体的构建将合成的信号肽序列退火，将退火产物与HindⅢ，BamHI双酶切的pRC-CMV质粒大片段用T4DNA连接酶在16℃连接过夜。用连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，经铺板、培养、扩增和酶切等方法初步筛选出阳性克隆，最后通过DNA测序确定阳性克隆。DNA片段回收，酶切鉴定，连接，转化等均按常规操作。2。5pRC-CMV-信号肽-hHER2-ECD片段载体的构建将PCR产物电泳，回收所需片段，用BamHI和XbaI分别双酶切PCR产物和质粒pRC-CMV-信号肽，将酶切后的PCR产物及质粒大片段用T4DNA连接酶在16℃连接过夜。用连接产物转化感受态大肠杆菌DH5α，经铺板、培养、扩增和酶切等方法初步筛选出阳性克隆，最后通过DNA测序确定阳性克隆。DNA片段回收，酶切，电泳鉴定，连接，转化，等均按常规操作。2。6质粒的提取与鉴定在连接产物转化后37℃过夜培养的培养皿上挑取边缘整齐，生长状态良好的克隆，接种到10mL含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃培养8h，用质粒提取试剂盒提取质粒，用相应内切酶双酶切后，进行琼脂糖凝胶电泳观察是否有插入片段以及插入的片段是否与预期的大小一致。将酶切鉴定阳性的克隆送北京奥科生物技术服务有限公司进行DNA测序。2。7真核表达载体的体外转染鉴定HEK293细胞按照5×105个·孔-1接种于细胞培养6孔板中，培养过夜，贴壁细胞在达90%-95％覆盖率时进行转染，转染按LipofectamineTM2000脂质体说明书进行操作。收集细胞，测定目的基因的表达。2。8分组并免疫小鼠BALB/c小鼠，共30只，体重：18g~22g，随机分为生理盐水组（Control），空质粒组（CMV），HER-2质粒组(CH)，每8只一组。免疫方法：质粒组用生理盐水溶解质粒，调整浓度为1mg·ml-1，100µl·只-1，腿部肌肉多点注射；生理盐水组200µl·只-1，腹腔注射。每两周免疫一次，共四次。2。9ELISA法测定血清抗HER-2抗体的效价在第4次免疫后7天采血，收集抗血清备用。用人HER-2/Fc蛋白溶液包被96孔板，1％BSA封闭；加入倍比稀释的抗血清、HRP标记的抗小鼠二抗，OPD显色，H2SO4终止反应后测OD490值。2。10ELISPOT法测定细胞免疫情况每组取四只小鼠，制备脾细胞悬液，用丝裂霉素C（50µg·ml-1）预处理的Her-2/neu+EMT6细胞体外刺激小鼠脾细胞。以脾细胞2。5×105个·孔-1、EMT6细胞1×105个·孔-1的混合细胞悬液加入到15µg·ml-1的鼠抗IFN-γ抗体包被的ELISPOT板子中，于37℃细胞培养箱中孵育4h，以下操作按照说明书进行。ELISPOT读数仪计数斑点。2。11接种肿瘤细胞最后1次常规免疫完毕后10天，取对数生长期状态的EMT6肿瘤细胞，按照1×106·只-1接种至小鼠背部皮下。之后每三周免疫一次。待观察到形成肿瘤组织块后隔天游标卡尺测量肿瘤的直径，计算肿瘤的体积。约一个月后用颈椎脱臼法处死动物，迅速分离出肿瘤组织称其湿重，并进行统计分析。2。12统计学方法数据用SPSS软件分析，显著性检验采用Dunnett’stest进行检验。3实验结果3。1pRC-CMV-信号肽载体的构建和鉴定将构建的含pRC-CMV-信号肽的质粒，用HindⅢ和BamHI进行双酶切鉴定（如图1），获得与预期结果一致大小的插入片段。经测序证实，该插入片段的基因序列与预期完全一致。图1重组质粒pRC-CMV-信号肽的酶切鉴定1：DNAmarker（DL2000），2：pRC-CMV-信号肽酶切产物3。2pRC-CMV-信号肽-hHER2载体的构建和鉴定我们以HER-2+的人乳腺癌细胞株SKBR3总cDNA做为模板，以相应的引物进行PCR，在约0。36kb长度处得到扩增片段（图2），回收此片段，用HindⅢ和XbaI双酶切，克隆入pRC-CMV-信号肽载体，并进行酶切鉴定(图3)，获得与预期结果一致大小的插入片段。经华诺生物技术服务有限公司测序证实，该插入片段的基因序列与预期完全一致。图2HER2cDNA的PCR扩增产物电泳图1：DNAmarker（DL2000），2：PCR产物bp2000100075050025010012bp2000100075050025010012图3pRC-CMV-信号肽-HER2的酶切鉴定1：DNAmarker（DL2000），2，3，4：pRC-CMV-信号肽-HER2的酶切产物3。3pRC-CMV-信号肽-HER2载体的体外转染鉴定瞬时转染HEK293细胞，24h后收集细胞提取细胞总RNA，进行RT-PCR，检测到pRC-CMV-信号肽-HER2真核表达质粒转染细胞后，目的基因在mRNA水平的表达与预期结果一致（图4）。图4HER-2胞外区片段基因在mRNA水平的表达1：DNAmarker（DL2000），2：重组质粒转染后的RT-PCR产物，3：空质粒对照3。4抗体滴度的鉴定ELISA法检测血清抗HER2抗体的效价，结果显示HER-2基因疫苗诱导的抗HER2蛋白的抗体滴度较低，只能达到1：200～300。3。5细胞免疫的测定ELISPOT检测每组小鼠产生IFN-γ的情况。结果显示，HER-2质粒组诱导产生了较高水平的T细胞反应，产生的IFN-γ水平明显高于对照组（P0.01）（如图5）。12320001000750500250