微生物风险监测标准操作程序

国家食品安全风险评估中心2014年微生物风险监测标准操作手册1/187第五章微生物检测方法标准操作程序国家食品安全风险评估中心2014年微生物风险监测标准操作手册2/187目录第一节微生物检测标准操作程序总体要求............................4第二节卫生指示菌标准操作程序....................................8一、菌落总数标准操作程序....................................8二、大肠菌群计数标准操作程序...............................13三、大肠埃希氏菌计数.......................................22四、霉菌和酵母菌检验标准操作程序...........................31第三节食源性致病菌检验标准操作程序.............................36一、沙门氏菌检验标准操作程序...............................36二、志贺氏菌检验标准操作程序...............................57三、大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验标准操作程序................69四、副溶血性弧菌检验标准操作程序...........................79五、金黄色葡萄球菌检验标准操作程序.........................91六、蜡样芽胞杆菌检验标准操作程序..........................105七、单核细胞增生李斯特氏菌检验标准操作程序................119八、阪崎肠杆菌检验标准操作程序............................129九、创伤弧菌检验标准操作程序..............................137十、铜绿假单胞菌检验标准操作程序..........................148十一、致泻大肠埃希氏菌检验标准操作程序.....................154第四节病毒检验标准操作程序....................................166一、诺如病毒检验标准操作程序..............................166第五节寄生虫检验标准操作程序..................................172一、异尖线虫检验标准操作程序................................172二、棘口吸虫检验标准操作程序................................174三、棘颚口线虫检验标准操作程序..............................175四、广州管圆线虫检验标准操作程序............................178五、华支睾吸虫检验标准操作程序..............................180六、并殖吸虫检验标准操作程序................................182七、东方次睾吸虫检验标准操作程序............................184国家食品安全风险评估中心2014年微生物风险监测标准操作手册3/187国家食品安全风险评估中心2014年微生物风险监测标准操作手册4/187第一节微生物检测标准操作程序总体要求一、样品接收1.当样品送达实验室后，应立即对照采样单核查样品，确保样品的相关信息完整并符合检验要求。核查内容包括：（1）样品数量；（2）包装是否完整；（3）采集样品的种类与采样方案的要求是否一致；（4）样品容器上的标记是否清晰可辨；（5）样品保存条件是否符合运输要求；（6）干燥样品是否受潮和有细菌增殖征象；（7）冷冻样品是否融化；（8）易腐样品有无腐败现象。记录样品核查结果并由核查人签字。若发现异常，不能接收，应重新采样送检。2.样品量不能少于规定数量，特殊情况送样量不足应说明。二、样品的标识和贮存1.样品标识样品应有正确、清晰的唯一性和状态标识，保证样品在检测过程中不被混淆。2.样品保存实验室接到样品后,应立即对样品进行检验；如果检验不能及时进行,应将样品在接近原有贮存温度条件下贮存并尽快检验。一般情况下易腐样品0℃～4℃不超过24h。三、检验样品的准备1.检验用培养基、试剂、标准物质和相关仪器设备应定期进行适用性核查；2.样品的全部制备过程均应遵循无菌操作程序；3.开启样品容器前，先将容器表面擦干净，然后用75%酒精消毒开启部位及其周围；4.确保所有待检样品都在保质期内且冷冻食品在检验前未解冻；5.如果检验过程出现了不可接受的偏差而终止，就要重新取样。国家食品安全风险评估中心2014年微生物风险监测标准操作手册5/1876.各类食品的检验准备（1）冷冻样品检验前应先融化。应在原装容器内45℃以下不超过15min或在2℃～5℃不超过18h解冻。一旦解冻就不能再次冷冻；（2）检验液体或半固体样品，取样前应先将其充分摇匀；（3）检验干燥粉状或颗粒状样品前，应先混合均匀；（4）固体样品，取样品的可食用部分进行检测。可用无菌镊子、剪刀剪碎，将样品搅拌均匀。如是动物性样品，避免取骨头作为检样。7、各类样品的称（量）取（1）非粘性液体样品（粘度不大于牛乳），可直接用吸管吸取一定量，加于适量的稀释液或培养基内，混合均匀。吸管插入样品内的深度不应超过2.5cm，不得将吸有样品的吸管浸入稀释液或培养基内；（2）粘性液体样品，可使用灭菌容器称取一定量，然后加入适量的稀释液或培养基，混合均匀；（3）粉状的固体和半固体样品，无菌手续准确称取一定量(±0.1g)，再加适量的稀释液或培养基进行均质（1min～2min）。（4）剪碎搅拌均匀后的固体样品，无菌手续准确称取一定量(±0.1g)，加入适量的稀释液或培养基进行均质（1min～2min）。均质后的样品应在15min内接种完毕。四、样品检验和数据处理1.必须严格按照《微生物检验标准操作程序》中规定的方法进行检验。2.检验过程中，接触食品、食品稀释液、培养基的一切器皿必须经过有效的清洁和灭菌处理。所有检验操作，必须严格遵循无菌操作程序和生物安全相关规定。3.检验过程中依据目的不同，应设置阳性对照、阴性对照和/或空白对照；4.检测人员对检测方法中的计算公式应正确理解，保证检测数据的计算和转换不出差错，计算结果应进行自校和复核。5.检测结果应使用检测方法规定的数量单位。6.采用计算机控制的自动化设备进行检测数据的采集、处理、记录、结果打印、储存、检索时，应保证数据完整不丢失；配备符合要求的工作条件和环境条件，使设备的功能正常和国家食品安全风险评估中心2014年微生物风险监测标准操作手册6/187安全运行；当所使用的软件发生修改后，应重新进行适当的培训；采取有效措施，防止非法访问、越权使用和随意修改，保障计算机应用的各级授权正常有效。7.进行数据处理软件投入使用前或修改后继续使用前的测试验证或检查，确认满足使用要求后方可运用。五、菌株保存对于每个阳性样品，保存检出的食源性致病菌分离株，以便用于进一步的研究；分离菌株的编号应具有唯一性，标识清楚；标签应防水、字迹耐冻；各省级实验室应建立食源性致病菌菌种库，妥善保存食源性致病菌分离株。推荐常见的食源性致病菌菌株保藏方法有以下2种：1.甘油冷冻保藏法（1）保藏时间本方法适合于菌种的长期保藏，保藏时间可达10年以上。（2）方法在充分加热混匀的BHI（副溶血性弧菌、创伤弧菌保存时BHI中NaCl应加至3%）中加入甘油，使甘油达总体积的40%～50%，充分混合，分装至菌种保存管（2mL左右），121℃高压20min，备用；使用无菌棉签从非选择性平板上取新鲜纯培养菌落，加入装有BHI和甘油的无菌冻存管中，混匀后，-80℃保存（如果无-80℃冰箱，可选择-40℃保存，但保存效果较差）。（3）注意事项每株菌至少保存2管，分别放置在2个不同冻存盒中，一盒日常使用，另外一盒长期保存；使用时，取出相应的冻存盒，快速接种，以避免反复冻融；使用时，无菌操作，避免污染。2.半固体保藏法（1）保藏时间本方法适合于短期菌种保藏，保藏时间一般为3～6个月。（2）方法无菌操作，挑取待保藏的菌种，穿刺接种约含5mL无菌半固体营养琼脂或半固体脑心浸液琼脂（副溶血性弧菌、创伤弧菌保存时BHI中NaCl应加至3%）的小试管（约15mm×100mm）中。无菌操作吸取灭菌液体石蜡，加入已培养好的菌种上面，液体石蜡用量以高出半固国家食品安全风险评估中心2014年微生物风险监测标准操作手册7/187体1cm为准，使菌种与空气隔绝。将试管直立，置4℃或室温（副溶血性弧菌、创伤弧菌）下保存。（3）注意事项副溶血性弧菌和创伤弧菌应放置室温保存。此外，也可以购买商品化的菌种保存管保存菌株，具体方法见生产厂家提供的操作指南。3.其他方法也可以购买商品化的菌种保存管保存菌株，具体方法见生产厂家提供的操作指南。六、检验后样品的处理检验结果报告后，被检样品方能处理。检出致病菌的样品要经过无害化处理。国家食品安全风险评估中心2014年微生物风险监测标准操作手册8/187第二节卫生指示菌标准操作程序一、菌落总数标准操作程序1方法来源GB4789.2-2010食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定2适用范围本程序规定了食品中菌落总数（aerobicplatecount）的测定方法。本程序适用于食品中菌落总数的测定。3术语和定义下列术语和定义适用于本程序。菌落总数aerobicplatecount食品检样经过处理，在一定条件下（如培养基、培养温度和培养时间等）培养后，所得每g（mL）检样中形成的微生物菌落总数。4设备和材料除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：4.1恒温培养箱：36℃±1℃，30℃±1℃。4.2冰箱：2℃～5℃。4.3恒温水浴箱：46℃±1℃。4.4天平：感量0.1g。4.5均质器。4.6振荡器。4.7无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。4.8无菌锥形瓶：容量250mL、500mL。4.9无菌培养皿：直径90mm。4.10pH计或pH比色管或精密pH试纸。4.11放大镜或/和菌落计数器或自动判读仪。5培养基和试剂5.1平板计数琼脂培养基：见附录A中A.1。5.2磷酸盐缓冲液：见附录A中A.2。5.3无菌生理盐水：称取8.5g氯化钠溶于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15min。5.41mol/LNaOH：称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中。5.51mol/LHCl：移取浓盐酸90mL，用蒸馏水稀释至1000mL。5.6菌落总数测试片和压板。第一法平板计数法国家食品安全风险评估中心2014年微生物风险监测标准操作手册9/1876检验程序菌落总数平板计数的检验程序见图1。图1菌落总数的检验程序7操作步骤7.1样品的稀释7.1.1固体和半固体样品：称取25g样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌均质杯内，8000r/min～10000r/min均质1min～2min，或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。7.1.2液体样品：以无菌吸管吸取25mL样品置盛有225mL磷酸盐缓冲液或生理盐水的无菌锥形瓶/（瓶内预置适当数量的无菌玻璃珠）中，充分混匀，制成1:10的样品匀液。或放入盛有225mL稀释液的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min，制成1:10的样品匀液。36℃±1℃48h±2h检样25g（mL）样品+225mL稀释液，均质10倍系列稀释选择2个～3个适宜稀释度的样品匀液，各取1mL分别加入无菌培养皿内培养计数各平板菌落数计算菌落总数每皿中加入15mL～20mL平板计数琼脂培养基，混匀报告国家食品安