新型AH1N1流感病毒的分子生物学特征

新型A/H1N1流感病毒的分子生物学特征流行性感冒简称流感，是由A、B、C三种流感病毒引起的急性呼吸道传染病。A型流感病毒根据其表面血凝素HA和神经氨酸酶NA基因的不同又可分成16个HA亚型(H1-H16)和9个NA亚型(N1-N9)。猪流感是一种由A型流感病毒引起的猪呼吸系统疾病。今年3月份由墨西哥发端的流感疫情目前已蔓延至36个国家和地区，其中18个国家已有确诊病例，2个国家有患者死亡。根据疫情病原体的基因组特征，其属于新型H1N1亚型猪流感病毒，世界卫生组织（WHO）称之为猪流感。虽然这种新型病毒是由猪流感病毒演变而来，但到目前为止这种病毒只导致人类患病，并在人与人之间传播，而猪感染仅发现一个病例，也没有有力证据证明本次流感疫情是从由猪传播开来的。因此，4月30日WHO将本次疫情改称为Ａ/H1N1型流感，不再使用“猪流感”一词。一、基因特征属于猪流感病毒利用流感病毒信息库和快速分析平台，对已报道的22株在病毒序列进行分析，各地分离株的核苷酸序列的同源性达到99%以上，属于同一株病毒。对HA基因和NA基因进行分析,确认引起本次疫情的病原体属于A/H1N1亚型流感病毒。同时对整个病毒的8条基因进行进一步分析，发现此次流行的病毒株包含一种较为独特的基因片段组合，是来自北美和欧亚两种猪流感病毒的混合体，但并未发现其具有典型的人流感和禽流感病毒特征。先前报道的本次新型流感病毒集中呈现了猪流感病毒、人流感病毒和禽流感病毒的特征，是来自猪、人和禽类等多物种来源的流感病毒杂交体的说法值得商榷。1.HA基因本次流行的流感毒株的HA基因核苷酸序列与早期从美国分离到的H1N2的猪流感病毒株的的同源性达到93%以上，其中与印第安纳州的H1亚型猪流感病毒(A/Swine/Indiana/P12439/00(H1N2))具有95%的同源性。提示本次A/H1N1流感病毒的HA基因由北中美洲本地的猪流感病毒变异而来。2.NA和M基因NA基因没有发生核苷酸缺失，其序列具有欧亚株系猪流感病毒的特征，同源性在90%以上的病毒都是来源于欧亚地区的H1N1猪流感病毒，其中与A/Swine/England/195852/92(H1N1),A/swine/Spain/WVL6/1991(H1N1)的核苷酸同源性达到了94%。M基因的核苷酸序列也与欧亚株系的猪流感病毒的同源性最高，达到96%。提示NA和M基因来源于欧亚株系的猪流感病毒。3.其它基因PB1、PB2、NP、NS基因的核苷酸序列与美韩等国分离到的猪流感病毒的同源性最高，达到96%；PA基因的核苷酸序列与美国本土分离到的猪流感病毒的同源性最高，达到96%。其中PB2和PA基因与2007年部分从南达科他州分离到的H3N2禽流感病毒的同源性也有96%。这种来自北中美和欧亚两种猪流感病毒的混合体是一种新型的A/H1N1病毒，以前从未发现这种重组病毒在猪群中感染和流行，也从未在美国以及其它国家的猪流感和人流感病毒分离株中出现中，GenBank中也未有类似基因组合的病毒序列的报道。欧亚猪流感病毒通常仅在欧亚流行，还没有报道说在人体内被发现过，人体对这种病毒缺乏免疫保护作用，这可能是此病毒快速传播的原因之一。这种具有典型猪流感病毒特征的重组病毒组合如何而来，如何传染到人体，为何仅在人与人之间传播而猪中却未发现，这一系列问题还未能解释。虽然到目前为止来自疫情发源地墨西哥的病毒样本还没有全序列可供参考，但是来之各地分离到的新型A/H1N1病毒的全序列同源性达99%以上，可以相信造成墨西哥以及全球流感疫情的病原体是同一种病毒。二、具备人与人之间传播能力猪流感病毒通常暴发于生猪当中，多见于秋季末期和冬季，发病率较高，病死率较低。目前，已从猪身上分离主要的流感病毒主要有H1N1、H1N2、H3N2三种亚型。人类一般不会患上猪流感，人感染猪流感病例多见与生猪接触的人员。历史上出现过一次猪流感疫情，1976美国新泽西州迪克斯堡的士兵中出现猪流感爆发，200多人患病1人死亡。但2005年12月至2009年2月期间，美国总共仅报道了12例人感染猪流感病例，但均未出现死亡，表明现有猪群间流行的猪流感病毒流感对人类的危害有限。但是，本次流感疫情的蔓延如此迅速，显示新型A/H1N1病毒具有较强的传染性。美国和墨西哥的患者绝大多数并未接触过猪，并且在猪中也未分离到该种毒株，仅在人群之间感染和发病，表明这种病毒已是由人-人形式传播，但是这种病毒在人际间传播的能力尚有待进一步评价。流感病毒的传播主要取决于HA蛋白的受体结合特异性，位于HA蛋白头部的受体结合位点（RBS），其主要由190位螺旋、130位环和220位环3个结构域组成。我们对7株美国分离到的毒株的HA基因进行分析，发现其HA蛋白的226位为Q，228位为G，具备H1亚型病毒典型的结合人样受体的特征。190位螺旋（190-198位）：DQQSLYQNA和130位环（135-138位）：VTAA的相关氨基酸与美国流行的猪流感病毒相一致；220位环（221-228位）：PKVRDQEG，其225位的D和227位的E与美国大部分的猪流感病毒分离株不一致，仅与06年美国Ohio分离株相一致，但与人H1亚型病毒的氨基酸完全一致性，提示新型A/H1N1流感病毒蛋白的受体结合特异性完全符合感染人类的要求，具备人传播人的分子基础的。进一步分析HA的裂解位点序列为PSIQSR↓GLFGAI，具有典型H1亚型的病毒特征，可被存在于人呼吸道细胞的某些特定的蛋白酶,如:胰蛋白酶、跨膜丝氨酸蛋白酶2/4(TMPRSS2/4）、人气道胰蛋白酶样蛋白酶（HAT）等所切割，利于病毒的复制增殖，引起呼吸系统感染。三、致病能力分析HA的糖基化，特别是头部RBS或抗原决定区附近的糖基化位点的增加或减少对病毒的抗原性及其生物学特性均有一定作用。受体结合位点的糖基化会影响病毒与受体的结合能力，抗原决定位点附近的糖基化则影响机体产生保护性的中和抗体，在裂解位点出现糖基化位点能直接影响HA蛋白的裂解。分析本次A/H1N1流感病毒的HA基因，其第98、153、183、190、194、225位的氨基酸分别为Phe、Trp、His、Asp、Leu，与其它来源的流感病毒一样呈现高度保守，保证受体结合区结构的稳定性。HA蛋白序列上共有8个糖基化位点，6个位于HA1区的第13、14、26、90、279、290位N上，2个位于HA2区第154、213位N上。HA蛋白158位无额外的糖基化位点，同时NA蛋白的颈部无氨基酸缺失的，这一组合在H5N1亚型流感病毒的研究中显示已出很强的致病力。进一步分析HA的裂解位点序列为PSIQSR↓GLFGAI，与典型H1N1亚型病毒在HA切割位点处的氨基酸序列相一致，尚未出现高致病性毒株的分子特征（RXR/KR↓GLF），仅可被存在于宿主呼吸道或消化道细胞的某些特定的蛋白酶和某些细菌酶识别并裂解，引起呼吸道或消化道的局部感染。但同样，1918年的西班牙流感的H1N1病毒株的HA裂解位点序列也为PSIQSR↓GLFGAI，没有插入多个碱性氨基酸，但致病性非常强，其本身的NA蛋白和HA的裂解有关，其中的机制还不清楚。因此低致病性流感病毒不仅能通过HA的突变增强毒力并且还能通过NA的突变增强毒力。PB2的627位氨基酸是A型流感病毒宿主范围以及病毒致病力的重要决定位点，当627位为为K时毒株致病力强，更适合于感染人类；627位为E时毒株致病力弱。本次A/H1N1流感病毒PB2的627位仍然保留致病力弱的为较弱的E。另外，本次A/H1N1流感病毒是来自北美和欧亚两种猪流感病毒的混合体，人类从未感染过此类病毒，机体对该病毒缺乏免疫保护能力，从而显示出其较强的致病能力。但目前还没有看到超级传播的现象发生，提示此次病毒的传播能力可能有限，可以获得有效防控。四、对药物敏感性的分析目前针对季节性的抗流感病毒药物主要有两类。一类是M2离子通道抑制剂：金刚烷胺（Amantadine）和金刚乙胺（Amantadine）；另一类是神经氨酸酶抑制剂：达菲（奥塞米韦，Oseltamivir）和扎那米韦（Zanamivir）。1.对M2离子通道抑制剂耐药流感病毒的耐药与抗病毒药物的使用具有非常大的关联性。最近全球多个国家感染新型A/H1N1病毒的患者已对金刚烷胺（Amantadine）和金刚乙胺（Rimantadine）耐药。金刚烷胺类药物对A型流感病毒的M2蛋白质具有阻碍功能作用，而对B型则无效。M2蛋白质形成4聚体，在酸性环境下活化离子通道而发挥作用。而金刚烷胺则通过抑制这种M2离子通道的功能而抑制病毒增殖。与流感病毒耐药有关的突变主要位于M2跨膜区域的部分氨基酸，现已证实L26F、V27A、A30T、S31N、G34E位中的氨基酸只要有一个或一个以上的变异就会导致耐药株的出现，特别是S31N的变异最为多见。该区域是金刚烷胺类药物的作用靶点，一旦氨基酸发生改变，导致产生高水平的耐药性。对本次A/H1N1病毒分析发现，其M2基因的31位点的氨基酸突变为N，具备耐药的分子基础。目前各亚型流感病毒对金刚烷胺的耐药普遍存在，有报道称H3N2亚型的耐药株会在金刚烷胺治疗2天后从病人体内分离到。由于金刚烷胺类药物极其容易产生广泛的耐药性，提示其可能已不适合作为流感病毒的预防和治疗用药。2、对神经氨酸酶酶抑制剂敏感临床报道的NA抑制剂抗性的产生，与使用的药物的不同而有所不同。通过达菲治疗以后，能够产生R292K、E119V、D198N和H274Y等突变。而通过扎那米韦治疗以后，只产生R152K的突变。病毒突变的发生存在着型特异性，例如，H274Y主要存在于N1亚型中，R292K和E119V主要存在于N2亚型中，R152K和D198N主要存在于B型流感病毒中。A/H3N2和A/H1N2对达菲比扎那米韦更为敏感，而A/H1N1和B型流感病毒，则正好相反。达菲对抑制N1、N4、N5和N8亚型的流感病毒具有较好的效果，而扎那米韦对抑制N2、N3、N6、N7和N9亚型的流感病毒NA活性具有更好的潜力。通过体外实验和反向遗传技术的实验表明，N2亚型的流感病毒的抗性与某些氨基酸是相关联的，R152K的突变能够引起B型流感病毒抗性的产生，而不能够使N2亚型的流感病毒产生抗性。在N1亚型的流感病毒中，只有H274Y的突变能够从体内和体外获得，而却没有在N2亚型的流感病毒中发生。尽管存在着药物使用产生的特异性和亚型的特异性，许多的催化氨基酸的突变导致了交叉抗性，框架氨基酸的突变（例如E119G）导致了对扎那米韦抗性的产生，但是保持了对达菲的敏感性；然而E119V的突变导致了对达菲的抗性的产生。在N1亚型的流感病毒中的H274Y突变，只对达菲抗性的产生起作用，而并不产生对扎那米韦的抗性。对本次A/H1N1病毒分析发现，其274位未发生由H到Y的突变，提示达菲等神经氨酸酶抑制剂类药物依然有效，这与临床的治疗效果相一致。五、抗H1N1常规疫苗是否有效目前针对猪流感病毒的疫苗只有用于猪的，还没有专门用于人类的。本次流行的A/H1N1是一种全新的流感病毒，属于北中美和欧亚株系猪流感病毒的混合体，从历史上看人类极少感染这两个株系的猪流感病毒，因此机体对该病毒缺乏免疫保护能力。目前使用的季节性流感疫苗都是在已知流感病毒中选取组成，由于人类季节性流感疫苗和猪流感在抗原性和基因上不一样，所以推测目前的流感疫苗不能有效预防本次流感疫情。有报道称在已完成的动物试验表明目前的疫苗对于正在全球肆虐的A/H1N1型猪流感病毒没有效果。我们通过比较疫苗采用病毒株和新型A/H1N1病毒株的HA抗原决定区氨基酸序列，来评价其交叉保护性。H1亚型流感病毒HA蛋白的球状头部具有5个抗原位点：Cb、Sa、Sb、Ca1和Ca2。A/SolomonIslands/3/2006为WHO推荐的2008-2009流感疫苗H1N1亚型的参考病毒株，我们比较其与A/H1N1流感病毒HA抗原位点的氨基酸序列的相似性（如下表）。比较结果显示两者在5个抗原位点的氨基酸均有很大不同，提示两株病毒的抗原性存在明显差异，因此推