AFLP分子标记实验流程

AFLP分子标记实验扩增片段长度多态性Amplifiedfragmentlengthpolymorphism（AFLP）是在随机扩增多态性（RAPD）和限制性片段长度多态性（RFLP）技术上发展起来的DNA多态性检测技术，具有RFLP技术高重复性和RAPD技术简便快捷的特点，不需象RFLP分析一样必须制备探针，且与RAPD标记一样对基因组多态性的检测不需要知道其基因组的序列特征，同时弥补了RAPD技术重复性差的缺陷。同其他以PCR为基础的标记技术相比，AFLP技术能同时检测到大量的位点和多态性标记。此技术已经成功地用于遗传多样性研究，种质资源鉴定方面的研究，构建遗传图谱等。其基本原理是：以PCR(聚合酶链式反应)为基础，结合了RFLP（限制性片段长度多态性）的分子标记技术。把DNA进行限制性内切酶酶切，然后选择特定的片段进行PCR扩增(在所有的限制性片段两端加上带有特定序列的“接头”，用与接头互补的但3-端有几个随机选择的核苷酸的引物进行特异PCR扩增，只有那些与3-端严格配对的片段才能得到扩增)，再在有高分辨力的测序胶上分开这些扩增产物，用放射性法、荧光法或银染染色法均可检测之。一、实验材料采用青稞叶片提取总DNA。二、实验设备1.美国贝克曼库尔特CEQ8000毛细管电泳系统，2.美国贝克曼库尔特台式冷冻离心机，3.美国MJ公司PCR仪，4.安玛西亚电泳仪等。三、实验试剂1.试剂：请使用高质量产品，推荐日本东洋坊TOYOBO公司的相关产品。DNA提取试剂盒；EcoRI酶,MseI酶，T4连接酶试剂盒；Taq酶，dNTP,PCRreactionbuffer；AFLP引物；琼脂糖电泳试剂：琼脂糖，无毒GeneFinder核酸染料替代传统EB染料；超纯水（18.2MΩ·cm）2．其他实验需要物品微量移液枪（一套）及相应尺寸Tip头,PCR管,冰浴等。四、实验流程1、总DNA提取使用DNA提取试剂盒提取植物基因组DNA，通过紫外分光光度计检测或用标准品跑胶检测。一般来说，100ng的基因组DNA作为反应模板是足够的。2、EcoR1酶消化（20ul体系/样品）EcoR11ul(10U/ul)10×Buffer2ul37℃2hrs65℃30min终止反应sample(总DNA)5ulddH2O12ul3、Mse1酶消化（20ul体系/样品）Mse12ul（1U/ul）10×Buffer2ulsample(EcoR1酶切产物)15ul65℃2hrs80℃30min终止反应ddH2O1ul4、T4DNALigase（20ul体系/样品）接头退火65度10分钟25度2小时T4DNALigase2ul(1U/ul)10×Buffer2ulsample(双酶切产物)10ulMse1Adaptor1ul（不稀释)22℃3hrs65℃10min终止反应EcoR1Adaptor1ul稀释10倍ddH2O4ul5、预扩增（20ul体系/样品）sample4ulPrimer(Mse1/EcoR1)1ul(100uM分别稀释14倍)AFLPCoreMix15ul*AFLPCoreMix配方：ddH2O8.8ulMgCl21.6uldNTPs(2.5mM)1.6ulTaq酶(1U/ul)1ul10×Buffer2ul预扩增程序：94℃2min94℃20s56℃30s20cycles72℃2min60℃30min6、选择性扩增（20ul体系/样品）sample4ul(预扩增产物稀释20倍)Primer(Mse1-XXX/EcoR1-XXX)1ul（M引物100uM稀释14倍，E引物100um稀释100倍）AFLPCoreMix15ul选择性扩增程序：94℃2min94℃20s66℃30s每循环降1℃，共10个循环72℃2min94℃20s56℃30s20个循环72℃2min60℃30min7、产物电泳检测上样液：LoadingBuffer20ulSizestandard-6000.2ulSample3ul(稀释10倍)四、实验结果与分析本实验使用贝克曼库尔特（BeckmanCoulter）公司CEQ8000遗传分析系统，运用先进的荧光标记技术和毛细管电泳分离技术进行实验，扩增产物在高分辨率毛细管中电泳分离，采用激光激发荧光采集数据，灵敏度极高，电泳结果通过软件自动统计分析并转换成“0、1”矩阵，便于对结果进一步深入分析研究，整个电泳、数据采集和数据分析过程由软件来控制完成，最大程度避免了人工操作造成的误差，提高了数据的可靠性。产物电泳数据采集在CEQ8000遗传分析系统上进行（图1），得到的数据（图2）用第三方软件再进一步统计分析。图1AFLP分子指纹图谱图2AFLP“0、1”矩阵图AFLP操作流程图：总DNAEcoR1酶切Mse1酶切连接接头预扩增选择性扩增优化电泳检测数据分析附录1：常用的8对AFLP选择性扩增引物：E-AGG:5-GACTGCGTACCAATTCAGG-3E-ACG:5-GACTGCGTACCAATTCACG-3E-AAC:5-GACTGCGTACCAATTCAAC-3E-ACA:5-GACTGCGTACCAATTCACA-3E-AGC:5-GACTGCGTACCAATTCAGC-3E-ACT:5-GACTGCGTACCAATTCACT-3E-AAG:5-GACTGCGTACCAATTCAAG-3E-ACC:5-GACTGCGTACCAATTCACC-3M-CAA:5-GATGAGTCCTGAGTAACAA-3M-CAC:5-GATGAGTCCTGAGTAACAC-3M-CAG:5-GATGAGTCCTGAGTAACAG-3M-CTA:5-GATGAGTCCTGAGTAACTA-3M-CAT:5-GATGAGTCCTGAGTAACAT-3M-CTC:5-GATGAGTCCTGAGTAACTC-3M-CTG:5-GATGAGTCCTGAGTAACTG-3M-CTT:5-GATGAGTCCTGAGTAACTT-3附录2：AFLP传统垂直板电泳(银染法检测)介绍：原理与方法同前，区别：1.选择性扩增引物不带荧光标记；2.电泳方法不同，采用测序胶垂直板电泳；3.电泳结果采用银染法，比较直观，但条带的统计与分析全人工化，工作量大，银染法灵敏度比荧光标记法要低。示例：下图为玉米(maize)DNA的AFLP图谱。PanelA:AFLPfingerprintsofcontrolmaizeDNAusingEcoR1primerE-AGGwitheightMse1primers:M-CAA(1),M-CAC(2),M-CAG(3),M-CAT(4),M-CTA(5),M-CTC(6),M-CTG(7),andM-CTT(8).PanelB:AFLPfingerprintsofcontrolmaizeDNAusingMse1primerM-CAGwitheightEcoR1primers:E-AAC(a),E-AAG(b),E-ACA(c),E-ACT(d),E-ACC(e),E-ACG(f),E-AGC(g),andE-AGG(h).