第六章食品安全现代生物检测技术第一节免疫学检测技术第二节

第六章食品安全现代生物检测技术第一节免疫学检测技术第二节PCR检测技术第三节转基因食品的检测技术•第一节免疫学检测技术•一、概述•抗原与抗体的结合反应是一切免疫测定技术的最基本原理。在此基础上结合一些生化或理化方法作为信号显示或放大系统即可建立免疫测定法，如放射免疫测定法、酶免疫测定法、荧光免疫测定法等。一个成功的免疫测定法必须具备3个要素：性能优良的抗体、灵敏和专一性的标记物和高效的分离手段。按照是否使用标记物分为标记免疫测定法和非标记免疫测定法，后者又称为经典免疫测定法；按反应介质分为均相或非均相(免疫复合物需分离后检测)免疫测定法；按反应状态分为平衡态或非平衡态免疫测定法。按照标记物种类，标记免疫测定法又分为放射性标记测定法和非放射性标记测定法。•目前最常用的免疫学检测技术如下：•（1）放射免疫测定技术•（2）酶免疫测定技术•（3）荧光免疫测定技术•（4）发光免疫测定技术•（5）胶体金免疫测定技术•二、酶联免疫吸附试验(ELISA)•（一）ELISA的基本原理•ELISA(Enzyme-Linkedimmunosorbentassay)的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。这一方法的基本原理如下。•（1）使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，井保持其免疫活性；•（2）使抗原或抗体与某种酶连接成酶标抗原或抗体，这种酶标抗原或抗体既保留其免疫活性．又保留酶的活性。•（二）ELISA的类型•ELISA可用于测定抗原，也可用于测定抗体。用于临床检验的ELISA主要有以下几种类型。•1双抗体夹心法测抗原•2双抗原夹心法测抗体•3间接法测抗体•4竞争法测抗体•5竞争法测抗原•（三）ELISA的材料与试剂•完整的ELISA试剂盒包含以下各组分：已包被抗原或抗体的固相载体（免疫吸附剂）；酶标记的抗原或抗体（结合物）；酶的底物；阴性对照品和阳性对照品（定性测定中），参考标准品和控制血清（定量测定中）；结合物及标本的稀释液；洗涤液；酶反应终止液。•1免疫吸附剂•2结合物•3酶的底物•4洗涤液•5酶反应终止液•6阳性对照品和阴性对照品•7参考标准品•三、磺胺二甲嘧啶的间接竞争ELISA检测•（一）人工完全抗原的合成•（二）合成抗原的鉴定•（三）抗体的制备与纯化•（四）标准竞争抑制曲线的制作•（五）畜产品中SM2残留的ELISA检测•（六）方法评价•1特异性•2灵敏度•3准确度•4精确度•第二节PCR检测技术•一、概述•PCR又称聚合酶链式反应(Polymerasechainreaction)，是1985年由美国的KaryMullis首创并由美国Cetus公司开发的一项体外扩增DNA的方法。应用该方法可使极微量的特定DNA片段在几小时内迅速扩增至百万倍，因而一经问世便在短短的数年内就得到了迅速发晨和实际应用，并在原有基础上结合各种生化分子生物学技术衍生出了许多改良技术。这些技术显示出了巨大的潜力，发挥着越来越大的作用，也正因为如此它们被誉为20世纪80年代分子生物学革命和生物技术的飞跃。•（一）PCR原理•PCR是依据DNA模板的特性，模仿体内的复制过程，在体外合适的条件下以单链DNA为模板，以人工设计和合成的寡核苷酸为引物，利用热稳定的DNA聚合酶延5’-3’方向掺人单核苷酸来特异性的扩增DNA片段的技术。•（二）PCR反应体系•PCR反应体系主要由引物、dNTP、DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、缓冲液、Mg2+和核酸模板组成。•（三）PCR反应参数•在PCR反应中每轮循环的各步反应时间不应过长，以免降低TaqDNA聚合酶的活性。下面介绍PCR反应中的一些具体参数。•1.变性•2.退火•3.延伸•4.循环次数•（四）常见的PCR种类•1.热启动PCR•2.一步单管PCR•3.多重PCR•4.依赖PCR的DNA指纹图谱技术•5.PCR-单链构想多态性分析•6.mRNA差异显示技术•7.随机引物扩增DNA多态性（RAPD）•8.以微卫星DNA介导的PCR技术•9.基因间重复性回文片段（REP）和基因内重复性一致序列（ERIC）的扩增•10.扩增片段长度多态性分析（AFLP）•11.限制性长度多态性分析（RFLP）•12.用于RNA病毒检测的核酸扩增技术•（五）PCR技术用于检测的主要步骤•（1）运用化学手段对目标DNA进行提取。•（2）设计并合成引物，引物设计或合成的好坏直接决定PCR扩增的成效。•（3）进行PCR扩增。•（4）克隆并筛选鉴定PCR产物，将扩增产物进行电泳、染色，在紫外光照射下可见扩增特异区段的DNA带．根据该带的不同即可鉴定不同的DNA。•（5）DNA序列分析•第三节转基因食品的检测技术•一、概述•转基因食品又称遗传修饰食品（geneticallymodifiedfood），简称GMF或GM食品。转基因食品大体上分为如下三类。•（1）转基因植物食品由转基因植物如转基因的玉米、大豆、水稻、马铃薯、番茄、香蕉、苹果、菠菜等生产加工而成。•（2）转基因动物食品如转基因的鱼、鸡、牛、羊等。目的主要通过导入外源基因或对自身基因加以修饰来使受体动物降低结缔组织交联度、改善肉质．或使受体生物个体肥大，或生产营养价值高的蛋、肉、乳等。•（3）转基因微生物食品如转基因微生物发酵而制得的葡萄酒、啤酒、酱油等，此类食品是利用转基因微生物（如转基因酵母和酶）的作用而生产出来的食品。后两类转基因食品目前在市场上还很少。•（一）ELISA技术与转基因食品检测•l.ELISA基本原理•建立在抗体抗原免疫学反应的基础上。•ELISA分析法必须具备待检测的固定相抗原或抗体、酶标记的抗原或抗体、酶作用的底物三种试剂，且满足两个前提条件：•待检测的抗原或抗体能够结合到不溶性载体表面并保持活性；•标记酶能与抗原或抗体结合并同样保持各自生物活性。•ELISA分析基本步骤如下：①将抗原（Ag）或抗体Ab结合到固相载体平板的孔里；②待测溶液的特殊抗原或抗体结合到敏化载体表面；③加入酶标抗体使之与抗原或抗体化合物相结合；④结合物通过标记酶催化底物的颜色改变而被检测；⑤通过最后溶液的颜色深浅对待侧抗原或抗体进行定量分析。•2.ELISA分析法的灵敏度•3.ELISA分析法的要点•特异性高，获得结果快，仪器简单，易于操作，对人员要求不高。免却了对样品进行核酸提取的麻烦，同时可降低检测的成本，由于酶既有很高的催化效率，可极大的放大反应效果，从而使测定达到很高的灵敏度和稳定性。•(二）PCR技术与转基因食品的检测•1.PCR技术对转基因食品的定性检测•（1）PCR基本原理PCR技术由美国Centus公司KaryMullis发明，20世纪90年代逐渐成熟应用。简单地说PcR就是利用核酸DNA聚合酶、引物和4种脱氧单核苷酸在试管内完成模板DNA的快速复制．•（2）PCR技术检测转基因食品的技术关键和理论依据•（3）PCR检测转基因食品的基本步骤•①待检材料DNA提取：通常利用CTAB法从食品材料中提取核酸；•②PCR反应：设计合适引物。PCR扩增待检样品中的靶标DNA；•③观测PCR产物：通过凝胶电泳分析将PCR产物展现；•④确定结果：有时为了避免假阻性，还需要对PCR产物进行限制性酶切分析进行质量控制。•2.PCR技术对转基因食品的定量检测•目前基于GMO特异DNA片段的定性PCR筛选方法已广泛应用于GMO食品检测．但是随着各国有关GMO标签法的建立和不断完善，对食品中的GMO含量的下限已有所规定。为此，研究者在定性筛选PCR方法的基础上发展了不同的定量GMO的PCR检测方法。目前，国外较为成熟的方法主要有半定量PCR法、定量竞争PCR(QuantitativecompetitivePCR)和Real—timePCR(实时定量PCR)法等三种。•（1）半定量PCR法•①样品DNA的提取和定量。•按常规方法提取DNA后，取部分样品DNA在0.8％琼脂糖凝胶中电泳，与已知古量的Marker比较，用计算机凝腔成像分析系统处理结果，以确定所提取的DNA量。例如，一般700mg的玉米粉可提取lμgDNA。•②PCR反应。•a.样品DNA的质量分析•b.建立内部参照反应体系•c.测定CaMV35S启动子的定量PCR反应•（2）定量竞争PCR法PCR反应实质是对特定模板DNA的指数扩增放大，而在相同的条件下，获得DNA的量与最初模板DNA的浓度成正相关，竞争定量PCR就是依据这种扩增DNA与模板DNA之间的浓度相关性设计的。基本原理是先构建含有修饰过的内部标准DNA片段(竞争DNA)，竞争DNA由质粒组成，带有一个改造PCR扩增子，改造部分可以是DNA插人序列、缺失序列或者点突变，竞争DNA与待测目标DNA在同一反应管中进行PCR共扩增，因竞争DNA片段和待测DNA的大小不同，经琼脂糖凝胶可将两者分开，通过比较两种条带的量可进行定量分析。•（三）生物芯片与转基因产品检测•就目前转基因食品检测中常用的ELISA和PCR技术而言，最大的缺点是检测范围窄，效率低，无法高通量大规模地同时检测多种样品，尤其是对转基因背景一无所知的情况下。对各种候选待检基因序列或蛋白的逐一筛查几乎是不可能的。而目前正在研究的转基因产品所涉及的基因数量有上万种，今后都有可能进入商品化生产，显而易见对进出口产品的检测，需要有更有效的、快速、特别是高通量的检测方法，最近几年出现的生物芯片技术能较好地解决这一问题。生物芯片根据所载探针种类分为基因芯片和蛋白质芯片两大类：基因芯片以DNA为探针。依据核酸杂交的原理检测样品中的特定基因序列；蛋白质芯片以蛋白质为探针，依据抗原抗体反应的免疫学原理检测样品中的特定蛋白质。