综合化学实验—配位化学和生物无机化学部分

综合化学实验——配位化学和生物无机化学部分切割DNA的金属配合物指导教师：毛宗万黄华珍[e-mail]@mail.sysu.edu.cn中山大学化学与化学工程学院2009年10月实验3功能型甘氨酸铜配合物的合成和表征•模板合成•IR光谱表征•自由基的UV光谱检测实验4功能型甘氨酸铜配合物对质粒DNA的切割•琼脂糖凝胶电泳•凝胶成像总学时：15学时地点：丰盛堂218室实验内容Ⅰ超螺旋DNAⅡ缺刻型DNAⅢ线型DNA自由基机理自由基进攻糖环或碱基，导致氧化破坏酯水解机理亲核试剂进攻磷原子，发生亲核取代反应酯水解机理优于自由基机理DNA结构及其断裂方式配合物与未受损的DNA表面结合并诱导其断裂进一步在新的断裂处结合断裂反应互补链的断裂DNA的自由基断裂实验背景——模拟博莱霉素在天然物质中，由5个氨基酸、2个六碳糖和1个氨基侧链构成的博来霉素（bleomycin）可导致DNA链的断裂,从而作为一族广谱抗菌抗肿瘤药物。导致DNA链的断裂原因是由于博来霉素分子的一部分是铁或铜的配合物，这类配合物能够产生导致DNA链断裂的自由基。CuP-3A的配位结构示意图博莱霉素的活性中心•Pamatong,F.V.;Detmer.C.A.,III;Bocarsly,J.R.;J.Am.Chem.Soc.,1996,118,5339.•Detmer.C.A.,III;Pamatong,F.V.;Bocarsly,J.R.;Inorg.Chem.,1996,21,6292.HNNHOCu(II)NH3+OOOHNNHOCu(II)NH3+OOO博莱霉素的模型化合物Cu2++e-=Cu+Cu++H2O2=Cu2++OH-+OHOHH2NOAOHH2NOAO2N2CH2OONHOAONHOAO2NCuCu2+NEt3ONHOAONHOA-Cl+H3NCu++1Zn/HCl2Cu(NO3)2A=H,phen,........12氨基酸铜化合物的合成路线OHH2NOAOHH2NOAOH2NOAOH2NOACuCu2+NEt3HCHOOH2NOAONOACuHHO2N-OH2NOAONHOAO2NCuONOAONHOAO2NCuH2C-ONHOAONHOAO2NCuHCHO模板反应的化学机理化合物1的红外光谱ONHOONHOO2NCu(COO-)(COO-)(NO2)(NO2)化合物2的红外光谱ONHOONHO-Cl+H3NCu(COO-)(COO-)(NH2)氢氧自由基的形成和UV光谱检测由于罗丹明B可与HO·迅速反应，并在553nm有强吸收，因此我们可以利用此反应采用分光光度法检验HO·的生成。琼脂糖凝胶电泳•琼脂糖凝胶电泳是一种非常简便、快速、最常用的分离纯化和鉴定核酸的方法•琼脂糖是从海藻中提取的一种线状高聚物•根据琼溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和低熔点琼脂糖•低熔点琼脂糖熔点为62～65℃，溶解后在37℃下维持液体状态约数小时，主要用于DNA片段的回收，质粒与外源性DNA的快速连接等凝胶浓度选择——琼脂糖凝胶的浓度与DNA分离范围琼脂糖浓度(%)线型DNA分子的分离范围(Kb)0.35～600.61～200.70.8～100.90.5～71.20.9～61.50.2～312.00.1～2电泳缓冲液•常用三种缓冲液Tris-硼酸(TBE)、Tris-乙酸(TAE)、Tris-磷酸(TPE)•TBE与TPE：缓冲容量高，DNA分离效果好，但TPE在DNA片段回收时含磷酸盐浓度高，容易使DNA沉淀•TAE：缓冲容量低，但价格较便宜，因而推荐选用TAE。缓冲液中的EDTA可螯合二价阳离子，从而抑制DNA酶的活性，防止PCR扩增产物降解核酸电泳的指示剂•指示剂：溴酚兰、二甲苯青•溴酚兰：在碱性液体中呈紫兰色，电泳中，溴酚兰的迁移率与双链线性DNA片段•二甲苯青：水溶液呈兰色，电泳时，其迁移速率与双链线性DNA大致相当琼脂糖凝胶浓度0.6%1%1.4%2%迁移率1Kb0.6Kb0.2Kb0.15Kb琼脂糖凝胶浓度1%1.4%迁移率2Kb1.6Kb核酸电泳的染色剂——溴化乙锭•一种荧光染料，EB分子可嵌入核酸双链的碱基对之间，在紫外线激发下，发出红色荧光•可在凝胶电泳液中加入终浓度为0.5ug/ml的EB，有时亦可在电泳后，将凝胶浸入该浓度的溶液中染色10～15min•琼脂糖凝胶EB染色，肉眼可见核酸电泳带，其DNA量一般5ng•溴化乙锭太多，凝胶染色过深，核酸电泳带看不清时，可将凝胶放入蒸馏水浸泡30min后再观察ethidiumbromide，EBN+H2NNH2C2H5Br-电泳实验装置•电泳仪（普通）•电泳槽（水平平板）•灌胶模具等电泳实验方法•洗净电泳槽，架好梳子•配制琼脂糖凝胶及倒胶•上样与通电•结果观察配制琼脂糖凝胶及倒胶•0.5×TBE电泳缓冲液100ml于三角烧瓶中，称取一定量的琼脂糖粉放入后沸水锅或微波炉内加热熔化，冷却至60℃(需要时可加入EB)，倒入电泳槽中，待凝固。•向电泳槽中倒入0.5×TBE，其量以没过胶面2mm为宜，小心移去梳子（如样品孔内有气泡，应除去）上样与通电•在DNA样品中加入0.2体积的载样缓冲液，混匀后，加入样品孔内•接通电源，一般红色为正极黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动（靠近加样孔的一端为负），电压为1—5V/cm（长度以两个电极之间的距离计算）•根据指示剂泳动的位置，判断是否终止电泳。一般电泳条件为：电压90V，时间40min。结果观察和记录•紫外仪上观察电泳带及其位置•拍照•进一步使用软件对光密度进行分析DNA断裂的凝胶电泳图IIIIIIⅠ超螺旋DNAⅡ缺刻型DNAⅢ线型DNA合成实验要点•检查回流装置是否保持干燥•硝酸铜在称量前用滤纸吸干固体表面潮解的溶液•合成实验中前半个小时注意观察反应混合物的颜色变化，亮蓝色或紫蓝色为反应正常•实验中化合物合成与DNA断裂实验需交叉进行，DNA断裂所需的配合物由准备室提供•若硝基还原使用了较多溶剂，需使用旋转蒸发器除去多余溶剂•凝胶电泳照相需戴手套模板合成——大环化合物的合成方法（218室）旋转蒸发器——除去多余溶剂（218室）红外光谱——化合物结构表征（201室）紫外可见光谱——跟踪罗丹明B与氢氧自由基的反应（204室）凝胶电泳——切割DNA（210室）凝胶成像分析——检测DNA断裂状况（210室）实验技术和方法实验要求•写好预习报告（查阅药品及溶剂的性质、羧基和硝基的IR特征峰值、光谱技术原理及思考题预习等）•实验中做好实验记录及相关计算（包括实验现象、产品重量、产率等）•做好每一次测试，并打印结果•实验结束时提交最终产品和测试图谱供检查•对实验结果作简要讨论•下一次实验提交本次实验报告•遵守实验规则，严禁违规操作，做好清洁值日（配位化学、生物无机化学、生物技术）V.V.Gerbeleu,V.B.Arion,J.Burgess,“Templatesynthesisofmacrocycliccompounds”,WILEY-VCHverlagGmbH,1999.计亮年，黄锦汪、莫庭焕等编著，《生物无机化学》（第二版），中山大学出版社，2001。杨频，高飞编著，《生物无机化学》，科学出版社，2002。F.奥斯伯，R.布伦特，R.E.金斯顿等，《精编分子生物学实验指南》，1998年6月第1版。参考书