细胞生物学实验指导

-1-细胞生物学实验指导编者梁亦龙张继承生物信息学院2004年9月-2-前言细胞是一切生物(包括人类)最基本的结构和功能单位。生命科学中的各个学科领域，甚至非生命科学的许多学科领域中的学者们，越来越多地投入到对细胞生命现象的研究。细胞是生命的载体，不理解细胞就不理解生命。在现代生命科学教学中，不设置细胞生物学课，所培养出来的学生就称不上是完全的生命科学家。在细胞生物学放学中，实验课不可或缺。实验课的基本任务是，让学生学习细胞生物学基本技术，使他们具有一定的实验操作技能，并培养他们树立独立设计实验的思考观念和进行科研的基本素质。我们借鉴兄弟院校的经验编写了这本《细胞生物学实验指导》，供我院开设的各专业选用。由于我们主客观条件所限，而且编写时间仓促，肯定会有不少缺点和错误，请提出批评意见，帮助我们不断改进教学。编者梁亦龙2004年9月-3-目录实验是规则与操作要求····················································1实验一细胞形态及大小的观测·············································2实验二相差和暗视野显微镜的原理、使用及标本观察·························5实验三荧光显微镜原理及应用·············································9实验四电镜参观························································12实验五植物细胞骨架的显示及光镜观察····································14实验六人淋巴细胞染色体标本制作·········································15实验七人淋巴细胞姐妹染色体区分染色·····································17实验八碱性磷酸酶的显示················································19实验九叶绿体的制备及其对染料的还原·····································22实验十人体细胞核型图的制作·············································24实验十一线粒体的分离及活性测定·········································27实验十二联会复合体的染色与观察·········································32实验十三细胞融合·······················································33实验十四死、活细胞鉴别················································39实验十五细胞固定染色法·················································41实验十六早熟染色体凝集（PCC）·········································43实验十七细胞同步化·····················································46实验十八动物染色体分带技术············································48实验十九线粒体的显示··················································50实验二十植物愈伤组织培养以及再分化·····································52实验二十一肿瘤细胞培养实验步骤········································57实验二十二细胞器的分离················································62实验二十三石蜡切片的制作···············································66-4-实验室规则与操作要求为获得较好的实验结果，避免发生差错与意外事故，特制定以下规则与要求，希望实验者能严格遵守。（一）显微镜的使用及保护①显微镜是细胞生物学实验的主要观察工具，使用时必须注意保持外观整洁、防湿、防高温、防药品侵蚀，使用时勿使染液或其它溶液沾污镜头，一旦沾污，及时用擦镜纸蘸上镜头清洗液（无水乙醚：无水乙醇＝7：3）轻轻擦拭干净。②带光源的显微镜待电压稳定后，将电源的光亮度调节器调至最小，再打开显微镜的电源，缓慢调节光亮度适当进行量度观察，观察完毕后，则先将光亮度调节器调至最小，然后再关闭显微镜电源开关。③镜头的清洗：实验完毕后，镜头的清洗很重要。用擦镜纸蘸取少量镜头清洗液，先从镜头的中央开始清洗，轻轻旋转擦至镜头的边缘部分，如此重复2－3次。④载物台必须保持清洁，必要时亦可用擦镜纸蘸少量清洗液擦试载物台。聚光器上的污物的去除亦可采用类似的方法。⑤使用完毕后，玻片一律取下，套上布袋.放回原处。本桌的显微镜一律不准搬离本实验桌。若需使用者，可到该桌使用，使用后务必保持该显微镜的清洁。如若发现违章使用情况，必追究使用者责任，本次实验作零分计。（二）实验时，实验室内，一律不准高声喧哗整洁，保持室内安静，认真操作，仔细做好各项观察与记录。（三）实验室内的一切仪器、物品必须爱护。节约材料、药品，取用时不要过量。公用物品不得独自占用，用后归还原处。（四）注意安全。使用有毒物品、强酸、强碱等，应严格按照操作规程。易燃物品远离火源。禁止湿手拿取电源开关或接触电源。如发生触电等事故，及时报告。（五）取用各种试剂，要用及时盖上瓶盖。按献宝取出所需之药品或溶液后，不得将原液倒回瓶内。滴管、玻棒、吸管不可混用。（六）实验中如有丢失、损坏仪器设备及用具，及时登记并报告，凡违反操作规程造成不应有的损失者，视其情节轻重，态度好坏，按有关规定处理。（七）本实验室欢迎各位实验者对每一实验本身提出新的看法与做法，至于能否采用，视具体情况而定。任何人未经老师许可，不得自作主张，改动任何实验步骤与操作方法。（八）实验完毕后，须摆齐药品，洗净器皿，做好本桌清洁。整个实验室清洁由本班班长安排。离开前要关好门、窗、水、电。实验一、细胞形态及大小的观测-5-一、目的：1.观测细胞形态及大小，了解细胞的分类2.学习显微测量的方法3.学习使用油镜二、测微技术的原理：显微侧微尺分为物镜测微尺（简称物微尺或台微尺）和目镜测微尺（简称目微尺）。目镜测微尺是一个可以放入目镜内的特制园玻片，玻片中央刻的刻度长5或10mm，将其分成50或100格（也有刻成十字形的）如下图。物微尺为一载片上贴着一圆形玻片中央带有刻度、长度为1mm，等分为100格，每一格长0.01mm（图一）。当测量细胞的大小时，不能用物微尺直接测量细胞，而只能使用目微尺。因目微尺测量的是细胞经物镜放大后的像，因而它每格所代表的实际长度随物镜的放大率而变，在测量时需先用物微尺标定，求出某一放大率时目微尺每格所代表的实际长度，然后再用以测量细胞大小。三、油镜的原理：油侵系物镜（简称油镜），与干燥系物镜不同，载波片和物镜之间的介质不是空气，而是一层香柏油，其折射率为1.515左右。和玻片折射率相近。光线通过载片后，可直接透过香柏油而进入物镜，折射程度轻，这样物镜的镜口率增大，从而提高物镜的分辨率。显微镜的分辨力与物镜的镜口率成反比，与光线的波长成正比；即：R=0.61λ/2NA=0.61λ/2n.sinα/2从上式可知提高介质的折射率可以提高显微镜的分辨能力，如果我们用NA为1.30的物镜，可见光平均波长为550nm即黄绿光，则分辨力为0.2μ。在油镜镜头上一般标有“0i1”，或有一黑色环等做为标志，油镜的放大倍数为90或100倍。四、实验用品：显微镜、测微尺、动物及植物的组织切片、香柏油、檫镜纸、二甲苯。五、实验操作1、目微尺的标定（1）卸下目镜的上透镜（如为Olympus显微镜，则卸下目镜下方的金属环），将目微尺刻度向下装在目镜的焦平面上，再旋上上透镜（金属环）。将目镜插入镜筒。-6-（2）将物微尺刻度向上放在镜台上夹好，以低倍镜调焦能看到物微尺的刻度，换上你用来测量细胞的物镜（本实验用油镜）。调焦至看清刻度，这时镜中同时看清两尺。小心移动物微尺和转动目镜，使两尺平行，起点线重合，如下图：然后找出另一处两尺刻度重合处，记录起点线到重合线之间各尺的刻度数（格数），按下式计算。在该放大系统下目微尺每格所代表的实际长度：目微尺每格所代表的实际长度（μ）=台微尺格数/目微尺格数*10（μ）（3）换上待测标本，既可进行测量。2、油镜的使用：（1）用低倍物镜，调焦观察，将待观察的部分移到视野中央。（2）旋开低倍镜，在玻片上的观察部位滴一滴镜油，将油镜旋入光路，这时油镜透镜应全部被油侵没。（3）调节细调螺旋，使视野清楚，即可观察（4）油镜的擦拭：在油镜使用结束后，用镜纸轻轻擦去镜头上的油，再用干净擦镜纸蘸上少许乙醚：无水乙醇（7：3）混合液擦去镜上残余的镜油，最后用干擦镜纸擦干，擦永久玻片或物微尺，方法类似。3、观察及测量（1）多角形细胞：观察小白鼠肝细胞，细胞呈多角形，分界不太明显，以苏木精-伊红染色，细胞质染成红色，细胞核染成兰色，测量其细胞及细胞核的长短径。（2）柱状细胞：观察河蚌外套膜两侧表皮细胞，细胞是高柱状或低柱状，一苏木精-伊红染色，测量细胞及细胞核的长短径。（3）梭形细胞：河蚌外套膜表皮以内，为结缔组织，其中有横肌和纵肌切面，细胞呈梭形，染色方法同上。（4）树枝状细胞：观察兔脊髓运动神经元，分布在脊髓灰质中，细胞突起呈树枝状。（5）卵园形细胞：观察人血细胞涂片中的红细胞、白细胞。4、洋葱根尖细胞大小测定及有丝分裂各时期的观察。（1）测量洋葱根尖分生区细胞和细胞核的长短径。（2）有丝分裂各时期的观察：1)前期：（Prophase）主要是染色质转变为染色体的过程，核仁核膜消失。2)中期：（Metephase），染色体分布在赤道面上。-7-3)后期：（Anaphase），含姐妹染色单体的染色体的着丝点分离形成两条染色体，分别向两极移动。4)末期（Telophase），染色体到达两极后，染色体解螺旋化成染色质，形成两个子核，核仁再次出现，一个细胞分裂成两个细胞。5、细胞器的观察⑴高尔基体a，观察脊神经节细胞；高尔基体银染成棕色，形状为网状或块状，分布在核周围的胞质中。b，观察河蚌外套膜表皮细胞；高尔基体染成棕色，呈网状，分布在柱状上皮的远心端（有极性分布）。⑵线粒体a，观察兔肝细胞：线粒体呈兰色线、粒状，均匀地分布细胞质中。b，观察兔小肠上皮细胞：线粒体呈兰色线、粒状。分布在柱状上皮细胞的细胞质中，分布呈两极状。即主要分布在细胞的顶部和基部。六、测量结果计算：1、公式为：椭球为：V=4πab2（a为长半径，b为短半径）球：V=4/3πR3（R为半径）2、根据观察与计算结果，填入下表：细胞名称形态特征细胞体积核体积核质比例小鼠肝细胞河蚌外套膜表皮细胞河蚌横肌细胞人血球细胞兔脊髓运动神经原细胞洋葱根尖细胞3、绘制高尔基体在兔脊神经节细胞，河蚌外套膜表皮细胞中的分布，以及线粒体在兔肝细胞，小肠上皮细胞中才分布草图。实验二相差和暗视野显微镜的原理、使用及标本观察-8-一、相差显微镜：人眼仅能观察到波长（颜色）及振幅（亮度）的差别。活细胞往往是无色透明的，通过活细胞的光线波长及振幅都无明显的改变，因此，在普通显微镜下我们难以观察到活细胞及结构。在实际工作中，许多的工作要求我们观察活细胞，人们设计了适合上述目的的观察工具，相差显微镜就是其中一种。（一）相差显微镜的原理：当照明光线通过活细胞时，虽然波长及振幅没有明显的变化，但由于细胞的各部分及细胞与周围介质之间折射率有所差别，光线