2014级硕士研究生细胞培养与细胞操作重点

1．细胞培养的概念指从体内取出组织，细胞制成单个细胞悬液，在体外模拟体内生理环境，在无菌，适当温度和一定营养条件下，使其生存和生长，并维持其生存和生长的特性，继续存活与增值。培养过程中不在形成组织。也可用已经建系形成的细胞株（系）复苏后继续培养，多是癌细胞，其目的是进行后续的生命科学研究，如细胞操作等。2．利用细胞培养技术进行生命科学研究的优点1研究的对象是活的细胞2研究的条件可以人为控制3研究的样本可以达到均一性4研究的内容便于观察、检测和记录5研究的范围比较广泛6研究的费用相对较经济3．试述影响体外培养细胞生长的各种因素。1无毒无污染的培养环境离体细胞缺乏防御能力，在有污染物和毒性物质的环境中生存可造成细胞生物学特性改变，甚至中毒死亡。生物、物理及化学因素都可能入培养环境造成污染。2恒定的生长温度组织和细胞培养的最适温度为35～37℃，培养细胞对低温的耐受力比对高温强3合适的气体环境开放培养时一般把细胞置于95%空气加5%CO2混合气体环境中4pH缓冲系统培养环境需保持pH值恒定，大多数细胞的适宜pH值为7.2～7.4。细胞耐酸性比耐碱性大一些，在偏酸环境中更利于细胞生长。一些细胞喜欢偏碱环境，如：成纤维细胞，最适pH是7.4～7.65理想的渗透压人血浆渗透压290mmol/L，是培养人体细胞的理想渗透压，鼠细胞渗透压在320mmol/L左右。细胞必须生活在等渗环境中，大多数培养细胞对渗透压有一定耐受性6湿度和光开放培养相对湿度控制在95%以上细胞培养需避光，紫外线或可见光可造成核黄素、酪氨酸、色氨酸等产生有毒的光产物，抑制细胞生长，降低其贴壁能力7影响细胞生长的其他因素放射线、机械振动、接触橡胶用品、细胞接种密度的大小都会对细胞产生影响4．细胞培养过程中常见的污染来源和污染类型有哪些？叙述各污染类型的特征。污染的来源：1不洁净的空气：空气是扩散微生物的最主要途径2消毒不彻底：各种培养器皿、器械洗刷不干净和消毒不彻底3操作不当：实验操作无菌观念不强，消毒不严格，交叉污染4不洁净的组织标本：组织标本表面清理、消毒不彻底，碘酒消毒后脱碘不彻底5使用污染血清：血清灭菌不彻底，潜在病毒和支原体污染污染类型：1支原体污染：无致死病毒，可与细菌长期共存，对细胞形态和功能的影响是潜在和持久的2病毒，细菌和霉菌污染：增殖迅速能在短时间内在数目上超过细胞或产生有毒物质杀死细胞3化学和物理性污染：化学物质混入培养液中后，有的毒性不大，被排除后，细胞仍可以继续增殖；有的化合物具有致癌性，能导致细胞发生转化。放射线，辐射污染可引起细胞代谢发生改变，如细胞同步化，生长受到抑制，甚至死亡4交叉污染：有些变化较轻微、不易察觉；严重时，污染的细胞优势生长，培养的目的细胞生长受抑，最终死亡5什么是天然培养基？什么是合成培养基？为什么在合成培养基里加入血清？1天然培养基有血清，血浆和组织提取液（如鸡胚，牛胚浸液）。其营养成分丰富，培养效果好，但来源受限成分复杂，易发生支原体污染。2合成培养基是指根据细胞生存所需物质的种类和数目，用人工方法模拟合成的。主要成份：氨基酸、维生素、碳水化合物、无机盐、缓冲体系和其它辅助物。3人工合成培养基只能维持细胞的生存，要想细胞生长和增值，还需添加一定量的天然培养基（如血清）。血清类型：胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、马血清，胎牛血清质量最好6.培养细胞环境中维持5%的CO2的意义。1调节营养液的pH值2在细胞的生长过程中会产生许多代谢废物，使培养基的pH值发生改变，当积累到一定程度时就会影响细胞的生长，所以需要CO2来缓冲3如果没有CO2，要维持培养液的一个相对稳定、正常的pH值，就需要经常的换液，过于频繁的换液细胞不容易适应，从而也会影响细胞的生存状态7贴壁细胞贴附和铺展的意义。1贴附的意义贴附于固相表面是锚定依赖性细胞生命活动的基本要求，细胞被接种到培养皿内以后首先要发生粘附，是细胞培养之后能否成功的第一步。需要贴附的细胞，悬浮后耽误的时间越长，越容易发生退化2铺展的意义铺展状况是调节细胞形状的主要方面，铺展的越好，细胞越扁，细胞与生长基质表面接触面积越大。铺展状况和细胞生长状况有密切的关系，铺展状况制约细胞的分裂生殖活动过程，只有当他浦站顺利到合适的程度DNA合成才开始进行。8原代细胞的各种分离方法及其原理是什么？1离心法：利用不同的离心速度，在选用悬液中某些细胞时，采用细胞分离液离心，不同比重细胞在分层液的不同层，收获目的细胞2机械分离法：将细胞用机械的方法分离3消化分离法：利用各种消化酶将组织块消化成单个细胞的方法包括1胰蛋白酶法，其作用与赖氨酸或精氨酸相连的肽键，使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分开2胶原酶法，对细胞间质的胶原有较好的消化作用3EDTA消化法，利用与细胞上的Ca2+Mg2+结合后的机械力使细胞变圆而分离9叙述悬浮细胞、半贴壁细胞和贴壁细胞的传代方法。1悬浮细胞：A直接传代法，悬浮细胞自然沉淀在瓶底，用吸管吸去上清液1/2至2/3，轻轻吹打成细胞悬液，等分装入数个培养瓶B离心传代法，将细胞悬浮液装入到数个离心管内，离心过后弃上清，加入新的培养液至离心管中，吸管吹打成细胞悬浮液，然后分瓶培养2贴壁细胞：消化法，弃去旧培养液---用PBS漂洗一次倒掉----加入消化酶消化----加入完全培养基用吸管反复地吹打瓶壁---调整至合适的细胞浓度，分瓶培养3半贴壁细胞：直接吹打法和硅胶刮除法10试述体外培养细胞的生命期及各期特点。细胞在体外培养过程中持续增殖和生长的时间叫做细胞的生命期它包括原代培养期，传代期和衰退期1原代培养期的特点：A原代培养期的细胞和体内原组织在形态和功能活动上相似性很大，细胞活跃可见细胞分裂但是不旺盛B细胞群是异质的，即各细胞的遗传性状不相同，细胞相互依存性强C原代培养细胞多呈二倍体模型D和体内的细胞性状相似，是药物监测好的实验对象2传代期特点：A在细胞的生命期中传代期的时间最长B在培养条件较好的情况下，细胞增殖旺盛，并能维持二倍体模型C一般情况下当传代10~50次左右，细胞增殖逐渐缓慢，以致完全停止，进入细胞第三期3衰退期特点：细胞仍然生存，但是增殖慢或者不增值，最后衰退凋亡11为什么无限细胞系的形成主要发生在传代期末或衰退期初？传代期末和衰退期是细胞的老化阶段，老化机制包括基因程序性因素和细胞内外环境中有害因素的影响，老化细胞癌基因容易被激活，老化细胞基因突变几率比较大，老化细胞结构蛋白，酶蛋白，受体蛋白合成减少，摄取营养物质和修复染色体损伤的能力均下降，严重缩短的端粒是细胞老化的信号。细胞发生转化并非单个分子时件，而是一个多步骤的过程，一般需要多个基因的改变。一个细胞要积累这些基因改变，一般需要较长的时间，这是细胞转化多发生在传代末期和衰退初期的重要原因。体外培养细胞无正常机体内的“免疫监视”，处于传代末期和衰退期的老化细胞发生转化时，更容易将其永生性或恶性性的“遗传优势”传递给子代细胞，从而形成无限细胞系12细胞冻存和复苏过程中，为什么要尽可能防止冰晶形成？防止冰晶形成的措施有哪些？细胞冻存冷冻保护剂的种类有哪些？1冰晶对细胞的损伤A对细胞造成机械损伤，细胞内冰晶还可能导致超微结构的破坏B细胞外冰晶导致细胞脱水，电解质浓集，蛋白质变性沉淀C渗透压和pH值改变对细胞造成损伤2防止冰晶形成的措施A程序化冷冻:将细胞置于4℃冰箱1h,-30℃2h,-70℃过夜,最后转移到液氮中保存B加入冷冻保护剂:与溶液中水分子结合，使溶液粘性增加，冰点下降,减少冰晶形成,减少溶质损伤C抗冻蛋白的应用:降低冰点,吸附于结晶的棱状表面，阻止冰晶的生长，抑制冰晶重结晶3冷冻保护剂的种类A渗透性保护剂：甘油、二甲基亚砜、丙二醇、乙二醇B非渗透性保护剂：聚乙烯吡咯烷酮（PVP），蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。13培养细胞纯化的方法有哪些？1自然纯化利用某些细胞的增长优势，在长期传代的过程中靠自然淘汰，不断地排挤其他生长较慢的细胞，最后留下生长旺盛的细胞，达到细胞纯化的目的.留下的细胞：成纤维细胞，突变细胞，肿瘤细胞等。2人工纯化利用人为的手段造成某一细胞生长有利的环境条件，抑制其他细胞的生长而达到纯化细胞的目的A胰蛋白酶消化法,使细胞间质中的蛋白质水解而使细胞分离。B机械刮除法，去除去不需要的细胞区域，而保留需要的区域C反复贴壁法，成纤维细胞比上皮细胞贴壁过程快，利用此差别可以纯化细胞D克隆法，将细胞分成单个细胞，加入到微孔培养板中，克隆性生长，筛选出所需要的克隆细胞群E细胞因子依赖纯化法，某些细胞需要特殊的细胞因子才能长期存活和生长繁殖14试述细胞凋亡的检测方法及各方法的原理。,1细胞凋亡的形态学检验：细胞凋亡之后细胞的形态发生改变，用一定的器械可以观测到，比如电镜，普通的显微镜，荧光显微镜等2磷酯酰丝氨酸（PS）外翻分析：正常的细胞的磷酯酰丝氨酸位于细胞膜的内侧，细胞凋亡后磷酯酰丝氨酸发生外翻到细胞膜的表面，暴露在细胞外环境中，利用一种磷脂结合蛋白特异性的和外翻的磷脂酰蛋白相结合，磷脂酰结合蛋白具有荧光效应，利用荧光显微镜，流式细胞仪等就可以观察到凋亡的细胞3线粒体膜势能的检测：细胞发生凋亡时，线粒体的跨膜电位发生改变，线粒体跨膜电位的存在，使一些亲脂性阳离子荧光染料可结合到线粒体基质上，其荧光的增强和减弱随着线粒体膜电位的改变而改变，因为可以测定细胞凋亡4DNA片段化分析：细胞凋亡之后染色质DNA断裂，形成寡核苷酸片段，在凝胶电泳上表现出梯形电泳图谱5TUNEL测定法：细胞凋亡时，內切酶（endonucleases）切断DNA，使3’-OH端暴露出来，标记物接上DNA3’-OH端，用荧光素、地高辛或生物素标记的脱氧尿三磷酸（DUTP)和末端脱氧核苷酸转移酶（TdT)相反应，DNA断裂点越多，标记物结合越多6Caspase-3活性的检测：Caspase-3是促进细胞凋亡的蛋白质，其活性增强则表明凋亡就极有可能被诱发15培养细胞活力检测的方法。细胞活力：在细胞群中总有一些细胞因各种原因而死亡的细胞，活细胞中生理活动和代谢能力也有一定的差别1活细胞百分率检测法：用台盼蓝染色，活细胞拒染，死细胞被染成蓝色2MTT法：活细胞线粒体中的脱氢酶能使外源性的MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶并沉淀在细胞中，而死细胞并无此功能3CCK-8法：被活细胞线粒体中的脱氢酶还原成具有高度水溶性的黄色物质，生成黄色物质的量和活细胞的数目成正比16试述细胞增殖生长状况相关指标的检测方法及各方法的原理。1细胞计数：测定培养基，血清，药物等对细胞生物学影响的手段2细胞生长曲线和倍增时间：生长曲线是细胞培养过程中最基本的指标，是测定细胞绝对生长数值和细胞增殖基本规律的常用简便方法。3细胞分裂指数：分裂细胞占全部细胞的百分比，表示细胞增殖旺盛程度4细胞贴壁率：又称贴壁细胞存活率，适用于观察贴壁附着细胞的生存能力和部分底物材料的生物相容性5克隆形成率：它反映了细胞群体依赖性和增值能力两个重要性状6细胞的增殖周期17密度梯度离心中速率—区带离心和等密度离心原理分别是什么？最主要的区别在哪里？1速率--区带离心原理:不同颗粒之间存在沉降系数差时，在一定的离心力的作用之下。颗粒各自以一定的速度沉降，在密度梯度不同区域上形成区带的方法2等密度离心原理:当不同颗粒存在浮力密度差时，再离心场下，在密度梯度介质中颗粒或上浮，或下沉，一直移动各自密度恰好相等的位置上形成区带，从而使不同浮力的颗粒得到分离3区别：离心介质、密度梯度范围与速率--区带离心不同，欲分离的颗粒密度处于离心介质密度范围内，介质梯度不需预先准备18．细胞核的分离技术和细胞脱核技术原理和方法。1细胞脱核是指采用物理或者化学的方法把细胞核从细胞中分离出来，形成无核的胞质体和无胞质的核质体，是一项经典的细胞生物学技术，可用于做各种研究，细胞融合，胞质，胞膜，胞核的成分研究以及开展染色体基因转移技术等2脱核原理：细胞松弛素B是肌动蛋白聚合的抑制剂，细胞在CB的作用下，微丝聚集受到抑制，细胞核与细胞质之间的链接变的松散，在离心力的作用下，细胞核脱离细胞质，从而得到去核细