070302光谱技术.

第五章紫外-可见分光光度分析Copyright©2010byOuyangHongsheng.Allrightsreserved.第五章紫外-可见分光光度分析欧阳红生动物生物技术系吉林大学畜牧兽医学院Email:[e-mail]:0431-87836175第五章紫外-可见分光光度分析•主要内容：基本原理紫外可见分光光度计第五章紫外-可见分光光度分析第一节基本原理一、概述二、紫外可见吸收光谱三、分子吸收光谱与电子跃迁四、光的吸收定律第五章紫外-可见分光光度分析一、概述基于物质光化学性质而建立起来的分析方法称之为光化学分析法。分为:光谱分析法和非光谱分析法。光谱分析法是指在光（或其它能量）的作用下，通过测量物质产生的发射光、吸收光或散射光的波长和强度来进行分析的方法。吸收光谱分析发射光谱分析分子光谱分析原子光谱分析第五章紫外-可见分光光度分析一、概述吸收光谱:又名吸收曲线。不同波长光对样品作用不同，吸收强度不同,以λ~A作图,所获的曲线.吸收光谱是材料在某一些频率上对电磁辐射的吸收所呈现的比率，与发射光谱相对。第五章紫外-可见分光光度分析一、概述发射光谱:物体发光直接产生的光谱叫做发射光谱分子光谱:分子的内部运动状态发生变化所产生的吸收或发射光谱(从紫外到远红外直至微波谱)。分子运动包括整个分子的转动，分子中原子在平衡位置的振动以及分子内电子的运动，因此，分子光谱一般有三种类型：转动光谱、振动光谱和电子光谱。第五章紫外-可见分光光度分析一、概述原子光谱:原子的电子运动状态发生变化时发射或吸收的有特定频率的电磁频谱。原子光谱是一些线状光谱，发射谱是一些明亮的细线，吸收谱是一些暗线。原子的发射谱线与吸收谱线位置精确重合。不同原子的光谱各不相同，氢原子光谱最为简单，其他原子光谱较为复杂，最复杂的是铁原子光谱。用色散率和分辨率较大的摄谱仪拍摄的原子光谱还显示光谱线有精细结构和超精细结构，所有这些原子光谱的特征，反映了原子内部电子运动的规律性。第五章紫外-可见分光光度分析在光谱分析中，依据物质对光的选择性吸收而建立起来的分析方法称为吸光光度法,主要有:红外吸收光谱：分子振动光谱，吸收光波长范围2.51000m,主要用于有机化合物结构鉴定。紫外吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围200400nm（近紫外区），可用于结构鉴定和定量分析。可见吸收光谱：电子跃迁光谱，吸收光波长范围400750nm，主要用于有色物质的定量分析。第五章紫外-可见分光光度分析二、紫外可见吸收光谱1．光的基本性质光是一种电磁波，具有波粒二象性。光的波动性可用波长、频率、光速c、波数（cm-1）等参数来描述：=c；波数=1/=/c光是由光子流组成，光子的能量：E=h=hc/（普朗克Planck常数：h=6.626×10-34J×S)光的波长越短（频率越高），其能量越大。白光(太阳光)：由各种单色光组成的复合光单色光：单波长的光(由具有相同能量的光子组成)可见光区：400-750nm紫外光区：近紫外区200-400nm远紫外区10-200nm（真空紫外区）第五章紫外-可见分光光度分析2.物质对光的选择性吸收及吸收曲线M+热M+荧光或磷光E=E2-E1=h量子化；选择性吸收;分子结构的复杂性使其对不同波长光的吸收程度不同；用不同波长的单色光照射，测吸光度—吸收曲线与最大吸收波长max；M+hM*光的互补：蓝黄基态激发态E1（△E）E2第五章紫外-可见分光光度分析吸收曲线的讨论：（1）同一种物质对不同波长光的吸光度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长λmax（2）不同浓度的同一种物质，其吸收曲线形状相似λmax不变。而对于不同物质，它们的吸收曲线形状和λmax则不同。（3）吸收曲线可以提供物质的结构信息，并作为物质定性分析的依据之一。（4）不同浓度的同一种物质，在某一定波长下吸光度A有差异，在λmax处吸光度A的差异最大。此特性可作为物质定量分析的依据。（5）在λmax处吸光度随浓度变化的幅度最大，所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。第五章紫外-可见分光光度分析3.紫外—可见分子吸收光谱与电子跃迁物质分子内部三种运动形式：（1）电子相对于原子核的运动（2）原子核在其平衡位置附近的相对振动（3）分子本身绕其重心的转动分子具有三种不同能级：电子能级、振动能级和转动能级三种能级都是量子化的，且各自具有相应的能量分子的内能：电子能量Ee、振动能量Ev、转动能量Er即E＝Ee+Ev+ErΔΕeΔΕvΔΕr第五章紫外-可见分光光度分析能级跃迁紫外-可见光谱属于电子跃迁光谱。电子能级间跃迁的同时总伴随有振动和转动能级间的跃迁。即电子光谱中总包含有振动能级和转动能级间跃迁产生的若干谱线而呈现宽谱带。第五章紫外-可见分光光度分析讨论：（1）转动能级间的能量差ΔEr：0.005～0.050eV，跃迁产生吸收光谱位于远红外区。远红外光谱或分子转动光谱；（2）振动能级的能量差ΔEv约为：0.05～１eV，跃迁产生的吸收光谱位于红外区，红外光谱或分子振动光谱；（3）电子能级的能量差ΔEe较大1～20eV。电子跃迁产生的吸收光谱在紫外—可见光区，紫外—可见光谱或分子的电子光谱第五章紫外-可见分光光度分析（4）吸收光谱的波长分布是由产生谱带的跃迁能级间的能量差所决定，反映了分子内部能级分布状况，是物质定性的依据。（5）吸收谱带强度与分子偶极矩变化、跃迁几率有关，也提供分子结构的信息。通常将在最大吸收波长处测得的摩尔吸光系数εmax也作为定性的依据。不同物质的λmax有时可能相同，但εmax不一定相同；（6）吸收谱带强度与该物质分子吸收的光子数成正比，定量分析的依据。第五章紫外-可见分光光度分析三、分子吸收光谱与电子跃迁紫外—可见吸收光谱有机化合物的紫外—可见吸收光谱，是其分子中外层价电子跃迁的结果（三种）：σ电子、π电子、n电子。分子轨道理论：一个成键轨道必定有一个相应的反键轨道。通常外层电子均处于分子轨道的基态，即成键轨道或非键轨道上。外层电子吸收紫外或可见辐射后，就从基态向激发态(反键轨道)跃迁。主要有四种跃迁所需能量ΔΕ大小顺序为：n→π＊π→π＊n→σ＊σ→σ＊第五章紫外-可见分光光度分析⑴σ→σ＊跃迁所需能量最大，σ电子只有吸收远紫外光的能量才能发生跃迁。饱和烷烃的分子吸收光谱出现在远紫外区(吸收波长λ200nm，只能被真空紫外分光光度计检测到)。如甲烷的λ为125nm,乙烷λmax为135nm。⑵n→σ＊跃迁所需能量较大。吸收波长为150～250nm，大部分在远紫外区，近紫外区仍不易观察到。含非键电子的饱和烃衍生物(含N、O、S和卤素等杂原子)均呈现n→σ*跃迁。如一氯甲烷、甲醇、三甲基胺n→σ*跃迁的λ分别为173nm、183nm和227nm。第五章紫外-可见分光光度分析⑶π→π＊跃迁所需能量较小，吸收波长处于远紫外区的近紫外端或近紫外区，摩尔吸光系数εmax一般在104L·mol－1·cm－1以上，属于强吸收。不饱和烃、共轭烯烃和芳香烃类均可发生该类跃迁。如：乙烯π→π*跃迁的λ为162nm，εmax为:1×104L·mol-1·cm－1。第五章紫外-可见分光光度分析⑷n→π＊跃迁需能量最低，吸收波长λ200nm。这种跃迁引起的吸收光谱，摩尔吸光系数一般为10～100L·mol-1·cm-1，吸收谱带强度较弱。n→π＊跃迁是从独立电子对向π电子系激发态的电子跃迁。对于含N=N，C=O，C=S，NO2，NO等基团的化合物或吡啶等的杂环化合物，可观测到由于这种跃迁引起的吸收光谱。丙酮n→π＊跃迁的λ为275nmεmax为22L·mol-1·cm-1（溶剂环己烷)。第五章紫外-可见分光光度分析生色团与助色团生色团：最有用的紫外—可见光谱是由π→π＊和n→π＊跃迁产生的。这两种跃迁均要求有机物分子中含有不饱和基团。这类含有π键的不饱和基团称为生色团。简单的生色团由双键或叁键体系组成，如乙烯基、羰基、亚硝基、偶氮基—N＝N—、乙炔基、腈基—C㆔N等。助色团：有一些含有n电子的基团(如—OH、—OR、—NH２、—NHR、—X等)，它们本身没有生色功能(不能吸收λ200nm的光)，但当它们与生色团相连时，就会发生n—π共轭作用，增强生色团的生色能力(吸收波长向长波方向移动，且吸收强度增加)，这样的基团称为助色团。第五章紫外-可见分光光度分析红移与蓝移有机化合物的吸收谱带常常因引入取代基或改变溶剂使最大吸收波长λmax和吸收强度发生变化:λmax向长波方向移动称为红移，向短波方向移动称为蓝移(或紫移)。吸收强度即摩尔吸光系数ε增大或减小的现象分别称为增色效应或减色效应，如图所示。第五章紫外-可见分光光度分析四、光的吸收定律1.朗伯—比耳定律•布格(Bouguer)和朗伯(Lambert)先后于1729年和1760年阐明了光的吸收程度和吸收层厚度的关系。A∝b•1852年比耳(Beer)又提出了光的吸收程度和吸收物浓度之间也具有类似的关系。A∝c•二者的结合称为朗伯—比耳定律，其数学表达式为：第五章紫外-可见分光光度分析朗伯—比耳定律数学表达式A＝lg（I0/It)=εbc式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；c：溶液的摩尔浓度，单位mol·L－１；ε：摩尔吸光系数，单位L·mol－１·cm－１；或:A＝lg（I0/It)=abcc：溶液的浓度，单位g·L－１a：吸光系数，单位L·g－１·cm－１a与ε的关系为：a=ε/M（M为摩尔质量）第五章紫外-可见分光光度分析透光度(透光率)T透过度T:描述入射光透过溶液的程度:T=It/I0吸光度A与透光度T的关系:A＝－lgT朗伯—比耳定律是吸光光度法的理论基础和定量测定的依据。应用于各种光度法的吸收测量；摩尔吸光系数ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度；吸光系数a(L·g-1·cm-1）相当于浓度为1g/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。第五章紫外-可见分光光度分析2.摩尔吸光系数ε的讨论（1）吸收物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数；（2）不随浓度c和光程长度b的改变而改变。在温度和波长等条件一定时，ε仅与吸收物质本身的性质有关，与待测物浓度无关；（3）可作为定性鉴定的参数；（4）同一吸收物质在不同波长下的ε值是不同的。在最大吸收波长λmax处的摩尔吸光系数，常以εmax表示。εmax表明了该吸收物质最大限度的吸光能力，也反映了光度法测定该物质可能达到的最大灵敏度。第五章紫外-可见分光光度分析（5）εmax越大表明该物质的吸光能力越强，用光度法测定该物质的灵敏度越高。ε105：超高灵敏；ε=(6～10）×104：高灵敏；ε2×104：不灵敏。（6）ε在数值上等于浓度为1mol/L、液层厚度为1cm时该溶液在某一波长下的吸光度。第五章紫外-可见分光光度分析第二节紫外可见分光光度计第五章紫外-可见分光光度分析一、仪器紫外-可见分光光度计第五章紫外-可见分光光度分析光源单色器样品室检测器显示1.光源在整个紫外光区或可见光谱区可以发射连续光谱，具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。可见光区：钨灯作为光源，其辐射波长范围在320～2500nm。紫外区：氢、氘灯。发射185～400nm的连续光谱。第五章紫外-可见分光光度分析2.单色器将光源发射的复合光分解成单色光并可从中选出一任波长单色光的光学系统。①入射狭缝：光源的光由此进入单色器；②准光装置：透镜或返射镜使入射光成为平行光束；③色散元件：将复合光分解成单色光；棱镜或光栅；④聚焦装置：透镜或凹面反射镜，将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝；⑤出射狭缝。第五章紫外-可见分光光度分析3.样品室样品室放置各种类型的吸收池（比色皿）和相应的池架附件。吸收池主要有石英池和玻璃池两种。在紫外区须采用石英池，可见区一