1143206_王震_几种辣根过氧化物酶底物的合成

中国药科大学本科生毕业论文（设计)中国药科大学本科毕业论文论文题目几种辣根过氧化物酶（HRP）的底物的合成英文题目synthesisofseveralsubstrateforhorseradishperoxidase专业制药工程院部工学院学号1143206姓名王震指导教师孙海鹰课题完成场所中国药科大学江宁校区论文工作时间：2015年3月至2015年6月中国药科大学本科生毕业论文（设计)几种辣根过氧化物酶（HRP）的底物的合成目录摘要.....................................................1前言.....................................................2第一章辣根过氧化物酶底物的发展..........................31.1色原底物.............................................31.2荧光底物.............................................31.3常见的化学发光底物...................................41.3.1鲁米诺化学发光体系..................................41.3.2过氧草酸酯类.......................................61.3.3吖啶及其衍生物......................................6第二章吖啶环上无取代吖啶酯的合成........................82.1引言.................................................92.2操作过程............................................102.2.1N-苯基茜素的合成.................................102.2.2吖啶-9-羧酸的合成................................102.2.3吖啶-9-酰氯的合成................................112.2.4两种吖啶-9-羧酸苯酚酯衍生物的合成................112.2.59-苯氧羰基-10-吖啶三氟甲基磺酸盐的合成...........122.2.6还原反应.........................................12第三章吖啶环上有取代吖啶酯的合成.......................14中国药科大学本科生毕业论文（设计)3.1引言................................................143.2操作过程............................................153.2.1异亚硝基乙酰对甲苯胺的合成........................153.2.25-甲基靛红的合成.................................15参考文献................................................16致谢....................................................18中国药科大学本科生毕业论文（设计)1几种辣根过氧化物酶(HRP)的底物的合成1143206王震摘要：辣根过氧化物酶是一种以亚铁血红素为氧化还原中心的过氧化物酶，从辣根等植物的根部提取而来，现在已经被广泛地应用在免疫分析、医学检测、荧光分析等众多领域。化学发光试剂是辣根过氧化物酶常见的一类底物，其中吖啶酯及其衍生物又是一类常见的高效化学发光试剂，因此本文中主要探索了两类吖啶酯衍生物的合成方法，并具体介绍了三个化合物的合成。关键词：辣根过氧化物酶，化学发光底物，吖啶酯，合成SynthesisofseveralsubstrateforhorseradishperoxidaseAbstract:Horseradishperoxidaseextractedfromtheplantsofhorseradishroots,isakindofperoxidaseofhemeastheRedoxcentersandwidelyusedintheimmunoassay,biomedicaltesting,fluorescenceanalysis.Chemiluminescentsubstrateisacommonsubstrateforhorseradishperoxidase,Acridineesterisakindofefficientchemiluminescence,Therefore,thisarticleismainlydesignedtosynthesizetwoseriesofacridiniumester,Thefirstisnosubstituentgroupsontheacridinering,Includingtwocompounds;Thesecondacridiniumesterthathassubstituentsontheacridinering.Keywords:horseradishperoxidase,chemiluminescentsubstrate,acridiniumester,synthesis中国药科大学本科生毕业论文（设计)2前言辣根氧化物酶由辣根等植物的根部提取而来，是一种含糖量为18%，分子量为44000D的糖蛋白。辣根过氧化物酶分子的氧化还原中心为亚铁血红素，辣根过氧化物酶对芳香族等化合物具有良好的催化氧化性能。相比较于其他过氧化物酶来说，辣根过氧化物酶有其自身的优点，如原料易得,市场价格比较便宜,作用底物十分宽泛等,这使得辣根过氧化物酶成为过氧化物酶中应用十分广泛的一种酶。现在，辣根过氧化物酶已广泛应用于各个领域之中，在免疫分析、有机合成、食品分析等方面，辣根过氧化物酶都发挥了重要的作用。例如在有机合成之中，可作为催化剂使用,对苯胺、酚类等芳香族化合物都具有很高的催化效能；在酶免疫分析检测中,辣根过氧化物酶具有化学发光底物,因此而建立的化学发光免疫测定在临床中得到广泛应用【2】。化学发光分析检测灵敏度高、本底低,因此作为辣根过氧化物酶的底物的化学发光试剂的研究和制备是化学发光免疫检测的热点。其中吖啶酯衍生物是一种常见的化学发光试剂【2】，因此本论文研究的目的是对两种吖啶酯衍生物的合成方法进行探索，合成三种不同的吖啶酯的衍生物，并在将来的工作中对各种吖啶酯的化合物的发光性能进行研究。中国药科大学本科生毕业论文（设计)3第一章辣根过氧化物酶的底物发展【3】1.1色原底物最早发现的辣根过氧化物酶的底物是色原，色原底物经过酶的作用会产生一种新的颜色或其吸收光谱产生变化，这种检测方法所产生的颜色很容易用肉眼或光谱仪器观测到是它最大的优点，对比之下，检测仪器所需的价格较其他检测方法更加便宜，但检测灵敏度较其他检测方法来说较低是其不足之处。不同取代的芳香族胺和酚可以用来表示色原底物的基本结构，在酶促氧化的过程之中，大多数不同取代的芳香胺、酚类或者它们的混合物会产生有颜色的缩聚物，易于观测。下面简单介绍几种常见的芳香族胺类色原底物:如四甲基联苯胺(TMB)、5-氨基水杨酸(5-AS)、邻联甲苯胺(OT)等，这三种色原底物的结构如下图所示：H2NNH2TMBH2NNH2NH2OHCOOH5-ASOT1.2荧光底物继色原底物之后，荧光底物的发现丰富了辣根过氧化物酶的的底物发展，荧光底物检测灵敏度比色原底物更高,更重要的是，荧光底物可以同时采用几种不同颜色的荧光材料，但与此同时，荧光底物也存在着其自身的缺点:首先，荧光的激发和检测所需要的光源、过滤器和扫描仪等设备价格昂贵，相对色原底物来中国药科大学本科生毕业论文（设计)4说，检测成本更高；其次，经由细胞或着其他分子产生的自发荧光同样会对实验的结果产生干扰；再次，在观测期间、样品存放期间、或者暴露于室内光线时，荧光会发生衰减,导致实验难以获得恒定数据。1.3常见的化学发光底物继荧光底物之后，化学发光底物的发现使得辣根过氧化物酶的底物发展进入一个快速发展的阶段，各种化学发光底物极大丰富了辣根过氧化物酶的应用。化学发光指的是物质分子在化学反应的过程当中吸收来自反应的能量，并以光的形式将能量释放出来的一种形式。化学发光的发光机理反应体系中某些物质吸收了来自反应所释放的化学能，然后物质分子从基态跃迁到激发态，当从激发态重新恢复到基态的状态时，反应体系所吸收的能量会以光的形式释放出来，从而产生发光现象。顾名思义，化学发光是指在化学反应的过程中所产生的化学能被吸收使分子激发而发射的光，荧光则是吸收了光能使分子激发而发射的光，这就是化学发光与荧光的区别所在，暨二者形成激发态分子的激发能的形式不同，一种为化学能，一种为光能。一般来说，化学发光底物具有高能化学键，酶的作用下，化学键会发生断裂，能量以可见光的形式释放。化学发光所需的检测仪器价格昂贵，发射光须随时采集，难以得到恒定值，但化学发光检测灵敏度高、背景低,因而得到广泛应用【4】。下面简单介绍几种常见的化学发光底物，包括鲁米诺类、过氧草酸酯类，以及吖啶酯类，它们在实际的化学分析测定中是常用的几种化学发光试剂，在药物分析，环境监测等领域也有着重要的应用：1.3.1鲁米诺化学发光体系鲁米诺，化学名为3-氨基邻苯二甲酰肼，其结构简单易于合成、性质稳定、水溶性好、环境友好且无毒，是应用最多的化学发光试剂之一，并以研究最多、化学发光效率高而著称【5】。鲁米诺作为一种常用的化学发光试剂可以用于多种物质的分析检测，如过氧化氢酶、辣根过氧化酶、铁盐、过渡金属离子等均可以作为氧化剂或催化剂增强中国药科大学本科生毕业论文（设计)5鲁米诺的化学发光。上述物质通过影响鲁米诺的化学发光速率，而进一步影响鲁米诺的化学发光强度，因此，鲁米诺可以用于上述物质的检测【6】。虽然鲁米诺可用于多种物质的分析检测，但至今为止，鲁米诺的化学发光机理仍未阐释清楚，主要原因在于捕获和分离反应中间体十分困难，所以，机理中仍然有一些细节难以明确。下面给出鲁米诺的一种可能的化学发光机理：如图展示了一种可能的鲁米诺的发光机制【7】：该机制经历四个阶段：第一阶段：luminol→LH-（luminol在碱性环境作用下，生成LH-阴离子）；第二阶段：LH-→L-（LH.）（LH-阴离子在氧化剂的作用下，生成LH。自由基或L-阴离子）；第三阶段：L-→LHOOH（L-自由基在过氧化物的作用下，生成LHOOH）；第四阶段：LHOOH→3-氨基邻苯二甲酸根负离子*+N2（LHOOH脱去N2，生成3-氨基邻苯二甲酸根负离子的激发态物质），最后，激发态物质回到基态的过程中，产生化学发光【8】。鲁米诺可以用于多种类型的离子的测定，例如可以用于金属离子的含量测定，关于测定海水中铁离子含量的方法已经建立起来，并应用于海洋环境监测之中；与此同时，在过渡金属检测和碱土金属离子检测方面，鲁米诺化学发光体系也发挥了重要的作用；当然除了过渡金属离子和碱土金属离子之外，过渡金属配NHNHNH2OOOHNHNOO氧化剂NNHOO过氧化物NNOHOOHONH2COOCOON2+hv中国药科大学本科生毕业论文（设计)6合物也影响金属的催化特性，因此鲁米诺也可以用于过渡金属配合物的检测。因此根据以上原理，可以通过鲁米诺化学发光体系建立各种离子的的检测方法。另外，以鲁米诺为化学发光试剂的化学发光免疫分析方法现以广泛应用于环境监测，药物分析，食品分析等领域【9】。1.3.2过氧草酸酯类过氧草酸酯类是一种常见的化学发光试剂，最早被发现的过氧草酸酯类化学发光体为草酰氯，后来，科学家们发现草酸酯和草酰氯一样具有化学发光的