1胶乳偶联方案的输出

方案一实验方法：一步法共价结合实验步骤：1、配制50mM的MES反应缓冲溶液，pH值为6.0；2、将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中，其浓度为10mg/L；3、用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）；4、将上述蛋白质溶液与胶乳微球混合，混合后在温室培育20分钟；5、用去离子水配制EDAC溶液，浓度为10mg/mL（52μmol/mL）；6、取计算量的EDAC溶液加到蛋白质与胶乳微球混合液中；7、用0.1M氢氧化钠（NaOH）溶液调整该反应混合液的pH值至6.5±0.2，在摇床温室培育2小时；8、将未结合的蛋白质除去，贮藏于缓冲溶液中。方案二实验方法：简单二步法共价结合实验步骤：1、配制50mM的MES反应缓冲溶液，pH值为6.0；2、将蛋白质溶解于反应缓冲溶液中，其浓度为10mg/L；3、用反应缓冲溶液稀释胶乳微球，使其浓度为1%（W/V）；4、1mL胶乳微球悬浮液，加入20mgEDAC，在室温培育40分钟，在20分钟后第二次加入20mg/mL；5、用相等体积的该缓冲溶液来洗涤胶乳微球，离心，用1倍体积的缓冲溶液重复处理；6、将蛋白质溶解于50-100mM的MES缓冲溶液中，蛋白质浓度为1mg/mL；7、再将胶乳微球悬浮于去离子水或结合的缓冲溶液中，迅速加入溶解的蛋白质，37℃搅拌反应3小时；8、按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合，搅拌反应10分钟；9、除去未结合的蛋白质，贮藏与贮存的缓冲溶液中方案三实验方法：生成NHS-酯的中间体二步法共价结合实验步骤：1、每ml反应混合物加入下列各物：a．去离子水是最后容积为1.0mL；b．0.1mL的10x的贮备缓冲溶液，其pH值为6.0-6.5（一般可用0.5MMES缓冲溶液）；胶乳微球最终浓度为1%（W/V）；c．0.23mL的50mg/ml的NHS在去离子水中的溶液；d．19.2mg/mL（100mM）的EDAC在去离子水中的溶液2、在室温将此混合物反应15-30分钟，不断搅拌；3、用MES缓冲液或纯化水洗涤胶乳微球悬浮物，除去未反应的NHS和EDAC；4、重新将胶乳微球在去离子水中悬浮，使其浓度为1%（w/v）；5、将结合的蛋白质溶于50-100mM的MES缓冲溶液中，浓度为1mg/mL；6、立即加入蛋白质溶液（胶乳微球、蛋白质和缓冲溶液的浓度分别为0.5%（w/v）、0.5mg/mL、25-50mM）；7、将混合物反应至少2小时，轻轻搅拌；8、按1mL反应混合液加入2.5μL乙醇胺混合，搅拌反应10分钟；9、除去未结合的蛋白质和乙醇胺，贮于适宜的贮存缓冲溶液中。附录试剂：MES缓冲液500mM和50mM；PH6.1；4°C储存（如果发黄或者污染，应倒掉）。EDAC盐酸1－乙基－3－二甲基氨基丙基二酰亚胺；52umol/ml：分析天平称取10mgEDAC，加入1ml去离子水。（EDAC对潮气非常敏感，在水中快速水解，EDAC储存于干燥器中，-5°C保存。）NHSN－羟基琥珀酰亚胺；50mg/ml水溶液蛋白质溶液蛋白质充分稀释溶解，浓度为1－10mg/ml技术说明：1．微球总表面积与其粒径成反比，抗体的具体用量需要根据使用微球的大小做相应改变；单位质量的微球表面积（m2/g）：A/M=6/PD其中D=微球粒径（µm）P=微球密度(聚苯乙烯1.05g/ml)例如：0.8µm的聚苯乙烯微球，A/M=6/1.05×0.8=7.14m2/g1.6µm的聚苯乙烯微球，A/M=6/1.05×1.6=3.57m2/g0.8µL，10mg聚苯乙烯微球需加入125－250µL多克隆抗体1.6µL，10mg聚苯乙烯微球需加入62.5－125µL多克隆抗体2．虽然疏水性吸附与缓冲液pH值无关，但反应缓冲液的pH值对被吸附蛋白质的构象有较大影响，进而影响其吸附效率。在等电点pH值条件下，更多的蛋白质疏水性吸附点暴露出来，利于其与微球作用；3．高效搅拌下，将微球分散液快速加入蛋白质反应缓冲液，可以获得最高的吸附效率和吸附均匀度；4．绝大部分的蛋白质很快被吸附，延长蛋白质与微球混合时间有助于蛋白质正确定位。方案五SampleProtocolforTwo-StepCarbodiimideCouplingofProteintoCarboxylatedMicrospheresMicrospheresshouldbeprotectedfromprolongedexposuretolightthroughoutthisprocedure.1.ResuspendthestockuncoupledmicrospheresaccordingtotheinstructionsdescribedintheProductInformationSheetprovidedwithyourmicrospheres.2.Transfer5.0x106ofthestockmicrospherestoaUSAScientificmicrocentrifugetube.3.Pelletthestockmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.4.Removethesupernatantandresuspendthepelletedmicrospheresin100μLdH2Obyvortexandsonicationforapproximately20seconds.5.Pelletthemicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.6.Removethesupernatantandresuspendthewashedmicrospheresin80μL100mMMonobasicSodiumPhosphate,pH6.2byvortexandsonicationforapproximately20seconds.7.Add10μLof50mg/mLSulfo-NHS(dilutedindH20)tothemicrospheresandmixgentlybyvortex.8.Add10μLof50mg/mLEDC(dilutedindH20)tothemicrospheresandmixgentlybyvortex.9.Incubatefor20minutesatroomtemperaturewithgentlemixingbyvortexat10minuteintervals.10.Pellettheactivatedmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.11.Removethesupernatantandresuspendthemicrospheresin250μLof50mMMES,pH5.0byvortexandsonicationforapproximately20seconds.SeeTechnicalNote1.12.Pelletthemicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.13.Repeatsteps11.and12.Thisisatotaloftwowasheswith50mMMES,pH5.0.14.Removethesupernatantandresuspendtheactivatedandwashedmicrospheresin100μLof50mMMES,pH5.0byvortexandsonicationforapproximately20seconds.15.Add125,25,5or1μgproteintotheresuspendedmicrospheres.(Note:Werecommendtitrationinthe1to125μgrangetodeterminetheoptimalamountofproteinperspecificcouplingreaction.)16.Bringtotalvolumeto500μLwith50mMMES,pH5.0.17.Mixcouplingreactionbyvortex.18.Incubatefor2hourswithmixing(byrotation)atroomtemperature.19.Pelletthecoupledmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.20.Removethesupernatantandresuspendthepelletedmicrospheresin500μLofPBS-TBNbyvortexandsonicationforapproximately20seconds.SeeTechnicalNote2.21.Incubatefor30minuteswithmixing(byrotation)atroomtemperature.(Note:Optional–performthisstepwhenusingthemicrospheresthesameday.)22.Pelletthecoupledmicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.23.Removethesupernatantandresuspendthemicrospheresin1mLofPBS-TBNbyvortexandsonicationforapproximately20seconds.SeeTechnicalNote3.24.Pelletthemicrospheresbymicrocentrifugationat≥8000xgfor1-2minutes.25.Repeatsteps23.and24.Thisisatotaloftwowasheswith1mLPBS-TBN.26.Removethesupernatantandresuspendthecoupledandwashedmicrospheresin250-1000μLofPBS-TBN.27.Countthemicrospheresuspensionbyhemacytometer.Calculation:Totalmicrospheres=count(1cornerof4x4section)x(1x104)x(dilutionfactor)x(resuspensionvolumeinmL)28.Storecoupledmicrospheresrefrigeratedat2-8°Cinthedark.TechnicalNote1:Couplingcanbeperformedin100mMMES,pH6.0withsimilarresults.Forsomeproteins,bettersolubilityandbettercouplingmaybeachievedatahighercouplingpHorinadifferentbuffer.Ifyourproteindoesnotcouplesatisfactorilyundertheserecommendations,tryPBS,pH7.4asanalternatecouplingbuffer.TechnicalNote2:EitherPBS-TBN(PBS,0.1%BSA,0.02%Tween-20,0.05%Azide,pH7.4)orPBS-BN(PBS,1%BSA,0.05%Azide,pH7.4)maybeusedasBlocking/StorageBuffer.TechnicalNote3:EitherPBS-TBNorPBS,0.05%Tween-20maybeusedasWashBuffer.附：蛋白质检测方法实验7考马斯亮蓝G-250染色法测定蛋白质含量一、目的1、学习一种蛋白质染色