根施甜菜碱对水分胁迫下烟草幼苗光合机构的保护

465植物生理与分子生物学学报,JournalofPlantPhysiologyandMolecularBiology2006,32(4):465-4722005-11-08收到，2006-06-16接受。国家“973计划”(No.G1998010100)、山东省自然科学基金(No.Y2003D03)和山东省烟草专卖局(KN747)资助。*通讯作者(E-mail:[e-mail];Tel:[phone])。根施甜菜碱对水分胁迫下烟草幼苗光合机构的保护马新蕾1，王玉军2，谢胜利2，李峰1，王玮1*山东农业大学1生命科学学院/山东省作物生物学重点实验室，2植物保护学院，泰安271018摘要：以烟草品种大黄金5210(抗旱性强)和中烟100(抗旱性弱)为材料，研究了水分胁迫对烟草叶片光合机构的影响，并通过根部施用甜菜碱的方法，探讨了甜菜碱对烟草光合机构的保护作用。结果表明:水分胁迫导致烟草幼苗光合机构损伤，表现在叶绿素含量、PSII光化学效率、希尔反应活力以及类囊体膜ATPase活性下降，且对抗旱性弱的中烟100损伤更加严重。外源甜菜碱处理减轻了水分胁迫对以上指标的降低程度，特别是对干旱敏感型烟草品种中烟100的效果更加明显。甜菜碱的这种保护作用可能与它能够维持叶片中各种抗氧化酶活性、减轻活性氧的积累、保护类囊体膜上各种色素蛋白的功能以及缓解水分胁迫对膜的破坏作用有关。关键词：甜菜碱；烟草；水分胁迫；光合机构中图分类号：Q945烟草作为重要的经济作物起源于雨量充沛的热带，对水分要求很高，在特定生长时期，田间持水量如果未能保持在50%以上，就会严重影响烤烟产量和品质(侯文华和杨同升1990)。对于干旱少雨的北方地区，干旱成为限制烟草种植的重要因素，如何提高烟草的抗旱性已经成为一项重要的研究课题。甘氨酸甜菜碱(glycinebetaine,GB)(以下简称甜菜碱)是一种季胺类化合物，其特定的分子结构使它对生物膜及蛋白质具有保护作用，可提高植物的抗性(Sakamoto和Murata2002;Park等2004;Waditee等2005;Quan等2004)。烟草自身不能积累甜菜碱，通过转甜菜碱合成酶基因的方法提高烟草体内甜菜碱积累量可以有效的提高烟草的抗性(Holmström等2000;Yang等2005)。但是，目前生产中烟草的种植拒绝转基因品种。通过外源施用甜菜碱的方法提高烟草体内甜菜碱含量是否也可以增加体内甜菜碱积累，进而改善烟草的抗胁迫能力？这方面的研究未见报道。本文以生产上种植的烟草品种大黄金5210(抗旱性强)和中烟100(抗旱性弱)为材料，研究了不同程度的水分胁迫对不同烟草品种抗旱性的影响，然后通过根施甜菜碱的方法，研究了外源甜菜碱对不同程度水分胁迫下烟草幼苗生理状况的改善作用。目的是一方面明确外源施用甜菜碱是否被烟草吸收并在体内积累，为利用甜菜碱提高烟草抗性提供新的途径与技术；另一方面进一步明确外源甜菜碱在提高烟草抗旱性方面的作用，并对其生理机制进行探讨。1　材料与方法1.1　试验材料培养供试材料为烟草生产上种植的抗旱性较强的烟草(NicotianatabacumL.)品种大黄金5210(DHJ5210)和抗旱性较弱的品种中烟100(ZY100)，由山东农业大学烟草科学系提供。选择优良烟草种子，用HgCl2消毒后播种于盛有育苗基质的营养钵内。营养钵置于盛水的搪瓷盘中。温室(25℃)自然光进行种子萌发、幼苗生长约60d，第4叶展开后移至直径10cm、高8cm的塑料盆中，温室内自然光常规管理，生长至7叶期用于实验。1.2　甜菜碱预处理选择长势一致的烟草幼苗分为两组进行溶液培养，一组用1/2Hoagland营养液培养，作为对照；另一组用含有1.7mmol/L(经预试为最佳浓度)甜菜碱(Sigma公司产品)的溶液(用1/2Hoagland营养液配制)培养。每天早晚各浇溶液一次，以保持甜菜碱浓度相对稳定，连续处理3d。1.3　胁迫处理甜菜碱预处理3d后，取足够数量的对照材料和甜菜碱预处理的烟草植株材料，用0、10%、20%和30%(W/V)的PEG-6000(1/2Hoagland营养液配制)溶液处理48h，以模拟不同程度的水分胁迫，期间46632卷植物生理与分子生物学学报给根系通气。试验设置为：始终用1/2Hoagland营养液培养(CK,0PEG)、10%PEG、20%PEG、30%PEG和GB+10%PEG、GB+20%PEG、GB+30%PEG共7个处理，每处理3次重复。取顶部第二、三片完全展开叶用于实验测定。1.4　甜菜碱含量的测定参考Gorham等(1982)的方法(稍做改动)提取和测定甜菜碱。称取0.5g冷冻材料，加入2mL甲醇-氯仿-KHCO3试剂(甲醇:氯仿:0.2mmo1/LKHCO3=12:5:1)，充分研磨后，转入10mL塑料离心管中，每次加2mL相同的试剂，将研钵洗涤2次；60℃恒温震荡水浴20min，冷却后10000×g(4℃)离心10min；转移上清液到50mL离心管中，对沉淀再提取2次，一次用与上述相同的试剂，一次用甲醇-水试剂(甲醇:水=1:1)，合并上清液，加2mL氯仿和4mL蒸馏水，充分摇匀，10000×g(4℃)离心10min，吸取上层水相到10mL量筒中，用蒸馏水定容至10mL，为甜菜碱的粗提液。将粗提液过离子交换混合柱(1mLAmberliteCG50的阳离子交换树脂，100~200目；2mLDowex1-X2的阴离子交换树脂，50~100目)，粗提液全部过柱后，先用3mL蒸馏水，再用4mL4mmo1/LNH4OH洗脱。收集洗脱液，旋转蒸发器减压蒸馏干燥，2mL甲醇溶解残渣，微孔滤膜过滤，利用岛津LC-6A型高效液相色谱仪(HypersilSCX10μm柱，4.6mm×250mm)，0.2mmo1/LNH4H2PO4(50%甲醇配制)为洗脱液，流速1mL/min，检测波长为195nm，进样量15μL测定甜菜碱含量。以Sigma公司的甘氨酸甜菜碱纯品为标样。1.5　叶片相对含水量(RWC)的测定按照Bajji等(2001)的方法测定。剪下叶片，擦干表面，迅速称量鲜重(FW)，然后将其浸于蒸馏水中，4℃下暗处放置24h吸水饱和，取出，吸水纸擦干表面水分，称量饱和鲜重(SFW)，然后放于烘箱80℃烘48h，称量干重，利用公式RWC=(FW-DW)/(SFW-DW)×100%计算相对含水量。1.6　叶绿素含量的测定按赵世杰等(2002)的方法。1.7　叶绿体的制备参照叶济宇和钱月琴(1985)的方法。研磨匀浆经4层纱布过滤，滤液于1℃下300×g离心约1min，上清液3000×g离心10min，沉淀用STN缓冲液(内含50mmol/L的Tris-HClpH7.8，蔗糖0.4mol/L，NaCl10mmo1/L)悬浮后冰浴保存。1.8　叶绿体Mg2+-ATPase和Ca2+-ATPase活性测定按黄卓辉等(1985)的方法进行，稍加改动。Mg2+-ATPase活性测定：Mg2+-ATPase激活液含50mmol/L的Tris-HClpH7.0，NaCl50mmo1/L，MgCl25mmo1/L，二硫苏糖醇(DTT)5mol/L。取lmL叶绿体悬浮液，加入1mL激活液于白炽光源(1000μmolm-2s-1)下激活6min。结束时加入牛血清蛋白(终浓度5mg/mL)终止激活反应。立刻取0.8mL激活叶绿体悬浮液，加入1mL反应液(内含Tris-HCl50mmo1/LpH8.0，MgCl25mmo1/L，ATP50mmol/L)混匀后37℃下反应10min(冰浴条件下反应作空白)。加0.2mL20%三氯乙酸终止反应。离心去沉淀，上清液取0.5mL用于无机磷测定。Ca2+-ATPase活性测定：取1mL叶绿体悬浮液，加入lmL激活液(内含Tris-HCl50mmo1/LpH8.0，EDTA4mo1/L，ATP2μmo1/L，胰蛋白酶0.4mol/mL)于20℃下激活10min，加入0.1mL(l0mg/mL)牛血清蛋白终止激活。立刻取0.8mL激活后的叶绿体悬浮液，加入lmL反应液(内含Tris-HC150mmo1/LpH8.0，ATP50mmol/L，CaCl25mmo1/L)。离心去沉淀，取上清液0.5mL用于无机磷测定。1.9　叶绿体Hill反应活力测定按叶济宇和钱月琴(1985)的方法。1.10　荧光参数的测定以英国Hansatech公司生产的FMS2脉冲调制式荧光仪测定初始荧光(Fo)和PSII的最大光化学效率(Fv/Fm)，测定前将叶片加入暗适应夹中暗适应20min。1.11　超氧阴离子自由基的测定参照罗广华和王爱国(1999)的方法。1.12　丙二醛含量测定参照赵世杰和李德全(1999)的方法。膜脂过氧化程度用丙二醛(MDA)的生成量表示。1.13　抗氧化酶(SOD、CAT、POD)的提取和活性测定取0.5g叶片放于预冷的研钵中，加1mL磷酸缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4)(pH7.8)冰浴研磨成浆，467马新蕾等:根施甜菜碱对水分胁迫下烟草幼苗光合机构的保护4期加缓冲液至终体积5mL。取2mL于12000×g下离心10min，以上清液为SOD、CAT、POD粗提液，参照Bartoli等(1999)的方法测定酶活性。1.14　实验数据处理实验结果均为3次或3次以上重复的平均值±SE。利用SAS9.0数据处理软件进行方差分析和差异性比较。为突出甜菜碱的作用，我们重点进行了品种内处理间的差异性比较，并对品种间的差异作了说明。2　结果2.1　根部施用甜菜碱对烟草叶片甜菜碱含量的影响测定了正常供水(CK)、水分胁迫处理(DS,20%PEG-6000)以及用甜菜碱预处理后再进行水分胁迫处理(GB+DS，GB+20%PEG-6000)的烟草叶片中甜菜碱的含量，结果如图1所示。对照组烟草叶片中甜菜碱含量很低，干旱处理后叶片中甜菜碱的含量基本没有变化(P0.05)，而甜菜碱预处理的一组叶片中甜菜碱含量显著增加(P0.01)。说明根施甜菜碱能被烟草根系大量吸收，并运输至叶中积累。结果充分证明通过外源根施的方法提高烟草叶片中甜菜碱的积累量是可行的。2.2　根部施用甜菜碱对水分胁迫下烟草品种叶片相对含水量的影响图2显示，随PEG浓度增加，不论是否经甜菜碱预处理，两品种烟草叶片相对含水量均呈现逐渐下降的趋势。10%PEG胁迫下甜菜碱处理的作用不明显(P0.05)，但是在20%、30%PEG胁迫下，甜菜碱处理显著(P0.05)缓解了相对含水量的下降。图1　根施甜菜碱对两烟草幼苗叶片甜菜碱含量的影响Fig.1　EffectsofglycinebetaineappliedthroughrootsontheglycinebetainecontentinleavesoftwotobaccocultivarsEachvalueisaverageof3replicates±SE(thesameasbelow).CK:Wellwateredtobaccoseedlings;DS:Droughtstressedseedlings;GB+DS:1.7mmol/LGBpretreatedanddroughtstressed.图2　根施甜菜碱对水分胁迫下两烟草幼苗叶片相对含水量的影响Fig.2　Effectsofglycinebetaineappliedthroughrootsontherelativewatercontent(RWC)inleavesoftwotobaccocultivarsunderwaterstress●:SeedlingswithGBpretreated;○:SeedlingswithoutGBpretreated.Thesameasbelow.2.3　根部施用甜菜碱对水分胁迫下烟草叶片叶绿素含量的影响图3表明，随胁迫程度加剧，两烟草品种叶片中叶绿素含量逐渐下降。与正常供水比较，10%PEG处理条件下，大黄金5210和中烟100的单位干重叶绿素含量分别下