(赵建乐)牛抗菌肽及其基因工程研究进展

牛抗菌肽及其基因工程研究进展赵建乐1，李引乾1，陈琛2，闫茂仓3，田泽华1，张晶艳1，张小莺1*（1.西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌712100；2.陕西理工学院陕西省生物资源重点实验室，陕西汉中723000；3.浙江省海洋水产养殖研究所，浙江温州325005）摘要：综述了牛抗菌肽（ABP）的类别、组织分布、生物活性、基因结构等方面的研究进展，对采用基因工程技术表达牛ABP的方法进行了评述，并展望了其转基因技术的应用前景，提出利用生物信息学构建牛ABP肽库的新思路。关键词：牛；抗菌肽；基因工程AdvancesinbovineantibacterialpeptidesandtheirgeneticengineeringZHAOJian-le1,LIYin-qian1,CHENChen2,YANMao-cang3,TIANZe-hua1,ZHANGJing-yan1,ZHANGXiao-ying1*(1.CollegeofVeterinaryMedicine,NorthwestA&FUniversity,Yangling712100,China;2.CollegeofBiologicalScienceandEngineering,ShaanxiUniversityofTechnology,Hanzhong723000,China;3.ZhejiangMaricultureResearchInstitute,Wenzhou325005,China)Abstract:Advancesinclassification,tissuedistribution,bioactivityandgeneticstructuresofbovineantibacterialpeptides(ABP)werereviewed.TheapproachstoexpressbovineABPviageneticengineering,andtheapplicationoutlookofthetheirtransgenetechnologywerediscussed.ThenewideasofbuildingbovineABPlibraryviabioinformaticswereproposed.Keywords:cattle;antibacterialpeptides;geneticengineering收稿日期:;修回日期:基金资助：西北农林科技大学引进人才启动专项基金（01140408）资助项目；2009西北农林科技大学基本科研业务费青年项目（109021003）；2009国家级动物科学实验教学示范中心建设项目；2009西北农林科技大学校级重点大学生创新性实验计划资助项目作者简介:赵建乐(1986-)，男（汉），河北邢台人，硕士生。*通讯作者，教授，从事药理学研究与新药研发，Tel：[phone]，E-mail：[e-mail]抗菌肽（Antibacterialpeptides，ABP）是生物长期进化过程中保留的天然免疫中的重要活性分子。它分布广泛,现已从哺乳动物、昆虫、两栖动物、植物、真菌、细菌等中发现了上千种ABP[1]。ABP抗菌谱广，可直接杀灭多种病原微生物，还可通过调节免疫系统激发一系列与炎症、免疫有关的生物效应，有些ABP还有抗肿瘤等作用[2]。有关ABP特性与机理的综述已有不少，此不赘述。本文专注于牛源ABP的研究进展。牛体内发现的ABP普遍理化性质稳定，对多种病原菌有抑杀作用，已成为众多表达系统外源导入基因的重要候选物。1牛ABP的分类及特点1991年Diamond从牛气管黏膜分离得到第一个牛ABP，至今已发现至少38种牛ABP，包括阳离子性的防御素（Defensins）和Cathelicidins、阴离子ABP及牛乳铁素。1.1防御素防御素是一类富含精氨酸和3个二硫键的阳离子ABP，根据半胱氨酸的位置和连接方式分为α、β和θ防御素。目前在牛体内只发现了β防御素，包括气管抗菌肽（Trachealantimicrobialpeptide，TAP）、舌抗菌肽（Lingualantimicrobialpeptide，LAP）、牛中性粒细胞β防御素（Bovineneutrophilβ-defensins，BNBDs）、小肠β防御素（Entericβ-defensin，EBD）等。1.1.1牛β防御素的基因结构及一级结构大多数已知的牛β防御素基因位于27号染色体的同一段序列上，均由2个外显子和1个内含子构成[3]。TAP基因的两个外显子被一个1.5kb的内含子所分割，第1个外显子编码信号肽，第2个外显子编码前序列和成熟肽[4]。LAP、BNBD、EBD的基因长度与TAP的相似，内含子都为1.5kb左右。而bBD-1的内含子则大得多，约8.5kb[5]。牛β防御素由约40个氨基酸残基组成，其中6个半胱氨酸分别以1-5，2-4，3-6相连，形成3对分子内二硫键[2](图1)。牛β防御素富含精氨酸，且其一级结构某些位置的氨基酸残基具有高度保守性(图1)。图1牛β防御素的一级结构Fig.1Primarysequencesofbovineβ-defensins恒定和高度保守的氨基酸以灰色表示；阳离子氨基酸（组氨酸、赖氨酸、精氨酸）用粗体表示；6个半胱氨酸分别以1-5，2-4，3-6相连，形成3对分子内二硫键。Theinvariantandhighlyconservedresiduesareshownasgray,andpositivelychargedresidues(H,K,andR)arebolded.Threedisulfidepairingsareformedbysixcysteineswith1-5,2-4,3-6connection.1.1.2牛β防御素的组织分布及活性牛β防御素主要分布在与外界环境接触较多的上皮组织和血细胞中（表1）。表1牛β防御素总结Tab.1Summaryofbovineβ-defensins名称(参考文献)Name(References)组织分布Tissuedistribution可诱导性Inducibility调节因子RegulatoryfactorsTAP[6]气管、肺泡巨噬细胞Trachea,alveolarmacrophages诱导型InducibleNF-κBNFIL-6LAP[7]消化道、呼吸道、乳腺上皮、结膜Digestivetract,respiratorytract,breastepithelium,conjunctiva诱导型InducibleNF-κBNFIL-6EBD[8]小肠Intestine诱导型InducibleNFIL-6BNBD4[9]中性粒细胞、气管、肺泡巨噬细胞、结肠、远端小肠、肺、脾Neutrophils,trachea,alveolarmacrophages,colon,distalsmall组成型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-1ALGQRSDSYICARKGGTCNLSPCPLYNRIEGTCYRGKAKCCIR123456intestine,lung,spleenBNBD5[9]中性粒细胞、气管、肺泡巨噬细胞Neutrophils,trachea,alveolarmacrophages组成型ConstitutiveBNBD12,13[9]中性粒细胞、气管、结肠、远端小肠Neutrophils,trachea,colon,distalsmallintestine组成型ConstitutiveBNBD1–3,6–11[9]中性粒细胞Neutrophil组成型ConstitutivebBD-1[4]乳头黏膜、肾脏、阴道、卵巢、输卵管、结肠Nipplemucosa,kidney,vagina,ovaries,fallopiantubes,colon组成型ConstitutiveDEFB401[3]乳腺Mammarygland诱导型InducibleTAP从牛的气管上皮分离得到[10]。TAP前原肽（Prepro-peptide）有64个氨基酸，包含20个氨基酸的信号肽和一个短的前序列(FTQGVG)。TAP可被多种病原体和促炎因子（TNF-a、IL-1b和LTA）诱导。脂多糖可增加TAP的表达量。TAP对金葡菌（Staphylococcusaureus）、大肠埃希菌（Escherichiacoli）、铜绿假单胞菌（Pseudomonasaeruginosa）、肺炎克雷伯菌（Klebsiellapneumoniae）和白色念珠菌（Candidaalbicans）的最小抑菌浓度（MIC）分别为25、12、25、12和6μg/ml。从牛舌上皮分离的LAP含42个残基，其前原肽由64个氨基酸组成，包含20个氨基酸的信号肽和2个残基的前序列(phe-thr)。LAP在消化道、呼吸道、乳腺上皮和结膜均有表达[11]。在溶血性巴氏杆菌（Pasteurellahemolytica）引起的急性感染和副结核慢性感染中均可观察到LAP表达[12]。患乳房炎时，LAP的表达量增加，表明LAP有抗乳房炎的作用[11]。LAP对S.aureus、E.coli、P.aeruginosa和C.albicans的MIC值分别为63、16、63和3μg/ml[13]。Selsted等[9]从牛中性粒细胞中分离到13种BNBDs。BNBDs包含38-42个残基，5kD左右，高度阳离子性。有些BNBDs还表达于气管、肺、肾、小肠中（表1）。大多数BNBDs对E.coliML-35和S.aureus502A的MIC值约为10μg/ml。EBD在牛的小肠末端和结肠中高水平表达[8]。在肠内隐孢子虫（Cryptozoite）的诱导下，肠道中EBDmRNA的表达量升高5-10倍，表明EBD在抗寄生虫感染中发挥作用[8]。Roosen等[3]用PCR技术，以牛β防御素基因的保守序列为引物，从牛细菌人工染色体文库中筛选出6个新的防御素基因：DEFB401、DEFB402、DEFB403、DEFB404、DEFB405和LAP-like。DEFB401表达于放线菌感染的组织，为诱导型表达。LAP-like与LAP的前原肽仅有一个氨基酸差异，由前原肽第