食品理化检验 维生素的测定

第十一章食品中维生素的测定DeterminationofVitamininFood一、概述二、脂溶性维生素的测定（重点、难点）三、水溶性维生素的测定（重点、难点）一、概述（一）维生素的分类及共性（二）常见维生素的生理功能（三）维生素的测定意义（一）维生素的分类目前已发现的维生素约有二、三十种，按溶解性可分为两大类：脂溶性维生素：A、D、E、K等；水溶性维生素：B、C等（如B1、B2、B6、B12和C等）维生素都具有以下共同特点：这些化合物或其前体化合物都在天然食物中存在；它们不能供给机体热能；也不是构成组织的基本原料；主要功用是通过作为辅酶的成份调节代谢过程，需要量极小；它们一般在体内不能合成，或合成量不能满足生理需要，必须经常从食物中摄取；长期缺乏任何一种维生素都会导致相应的疾病。维生素A：是人体必需营养素，能促进人体发育，防止眼膜炎、夜盲症等疾病。维生素B1：也叫硫胺素，对人体的功能主要是防脚气病、神经炎，帮助消化，促进发育。维生素B2：对人体功能防口角炎、皮肤炎，防止怕光现象。维生素C：防坏血病，促进外伤愈合，使机体增强抵抗力。维生素D：调节体内矿物盐的平衡，特别是对人体内钙、磷的代谢，并能防止软骨病。（二）常见维生素的生理功能（三）维生素的测定意义评价食品的营养价值；开发利用富含维生素的食品资源；指导人们合理调整膳食结构，防止维生素缺乏症；研究维生素在食品加工、贮存等过程中的稳定性，指导制定合理的生产工艺条件及贮存条件，最大限度地保留各种维生素；监督维生素强化食品的强化剂量，防止维生素摄入过多引起中毒。二、脂溶性维生素的测定脂溶性维生素的理化性质脂溶性维生素的测定方法常与脂类物质共存于食物中，摄食时一道被人体吸收。1.溶解性：不溶于水，易溶于脂肪、乙醇、丙酮、氯仿、乙醚、苯等有机溶剂；2.耐酸碱性：维生素A、D对酸不稳定，对碱稳定；维生素E对酸稳定，对碱不稳定，但在抗氧化剂存在下或惰性气体保护下，也能经受碱的煮沸。（一）脂溶性维生素的主要理化性质3．耐热性、耐氧化性：耐热性氧化性VA好，能经受煮沸易被氧化（光、热促其氧化）VD好，能经受煮沸不易被氧化VE好，能经受煮沸在空气中能慢慢被氧化（光、热、碱促其氧化）根据上述性质，测定脂溶性维生素时，通常：皂化样品类脂物和维生素分开有机溶剂提取脂溶性维生素(不皂化物)浓缩溶于适当的溶剂测定。（食物中脂溶性维生素常与脂肪共存，一道被人体吸收，所以要除去脂肪，防止干扰。）在皂化和浓缩时，为防止维生素的氧化分解，常加入抗氧化剂(如焦性没食子酸、维生素C等)。对于A、D、E共存的样品，或杂质含量高的样品，在皂化提取后，还需进行层析分离。常用的测定方法有:薄层色谱法、分光光度法、气相色谱法、高效液相色谱法等。高效液相色谱法：快速、高效、高灵敏度等优点，是我国卫生标准分析方法（二）脂溶性维生素的测定方法食品中VA和VE的测定（GB5009.82-2003)维生素A：存在于动物性脂肪中，主要来源于肝脏、鱼干油、蛋类、乳类等动物性食品中；植物性食品中不合VA，但在深色果蔬中含有胡萝卜素，它在人体内可转变为VA，故称为VA原;包括A1和A2。维生素E：（第一法）HPLC测定VA和VE一、原理食品样品经皂化处理后，用有机溶剂将食品中的脂溶性维生素（如维生素A、维生素E）从不可皂化的部分提取出来，经过浓缩除去有机溶剂，再用适当的溶剂溶解后，用HPLC法C18反相柱将VA和VE分离，经紫外检测器，用内标法测定其含量。二、样品处理（1）皂化：称取适量样品（含VA30μg,VE40μg）于三角瓶中，加30mL无水乙醇，振摇使样品分散；加入5mL，100g/L抗坏血酸和2mL苯并[e]芘溶液（内标）混匀，加入10mL氢氧化钾(1:1)，混匀，于沸水浴上回流30min，使皂化完全（若有混浊现象，表示皂化完全），皂化后立即放入冰水中冷却；（2）提取：将皂化液移入分液漏斗，先用50mL水分2次洗涤皂化瓶（若有渣，可经过脱脂棉过滤），再用100mL无水乙醚分2次洗涤皂化瓶及残渣，所有乙醚洗液并入分液漏斗中，振摇两分钟（注意放气），静止分层后，弃去水层；然后每次用100mL水将乙醚液洗至中性，需洗4-5次。（3）浓缩：将乙醚提取液经无水硫酸钠滤入150mL旋转蒸发瓶内，用约15mL乙醚洗涤分液漏斗和无水硫酸钠2次，洗液并入蒸发瓶中，于55℃水浴中减压蒸馏并回收乙醚，待瓶中乙醚剩余约2mL时，取下蒸发瓶，用氮气吹干乙醚，随即加入2mL乙醇，充分混合、溶解提取物。将乙醇移入塑料离心管中，于离心机上离心5min，上清液供色谱分析用。三、所需主要仪器高效液相色谱（带紫外分光检测器）旋转蒸发器高速离心机（带离心管）恒温水浴锅紫外分光光度计说明：国标中用其来标定VA和VE的浓度四、液相色谱分析色谱参考条件：预柱：ODS10μm（4mmx4.5cm)分析柱：ODS5μm（4.6mmx25cm)流动相：甲醇：水＝98：2，混匀，临用前脱气；紫外检测器波长：300nm，量程0.02；进样量：20μL;流速：1.65～1.70mL/min测定（1）配制标准溶液VA标准溶液：将VA标准品用无水乙醇溶解配制成浓度为1mg/ml;VE标准溶液:用无水乙醇分别溶解α-生育酚、γ-生育酚、δ-生育酚3种标准品，配制成浓度为1mg/ml的标准液；内标溶液：将苯并『e]芘用无水乙醇配制成浓度为10μg/ml;（2）绘制标准曲线将一定量的VA标准溶液、3种VE标准溶液和内标溶液混和均匀，对其混和液进行色谱分析，以维生素峰面积和内标物峰面积之比为纵坐标，以维生素浓度为横坐标，绘制标准曲线（直线回归方程）。（3）样品测定取试样浓缩液20μl注入色谱仪中，进行检测；定性：用标准物色谱峰的保留时间定性；定量：根据色谱图求出某种维生素峰面积与内标物峰面积的比值，以此比值由回归方程求出维生素含量；五、结果计算X：某种维生素的含量，mg/100gρ：由标准曲线上查到的某种维生素含量，μg/mLV：样品浓缩后定容体积,mLm：样品质量，g1000100mX水溶性维生素的理化性质维生素B1的测定维生素B2的测定维生素C的测定三、水溶性维生素的测定易溶于水，不溶于大部分有机溶剂；在酸性介质中稳定，在碱性条件下不稳定；易受空气、光、热、酶、金属离子的影响。（一）水溶性维生素的主要理化性质（二）维生素B1的测定VB1又叫硫胺素、抗神经炎素1、食品中VB1的存在形式⑴常以游离态存在；⑵复合脂形式存在（磷蛋白）；⑶辅羧酶形式存在VB1在酵母、米糠、麦胚、花生、黄豆以及绿色的蔬菜和牛乳、蛋黄中比较丰富，动物组织不如植物含量丰富。⑴VB1在中性、碱性下不稳定，易分解；⑵VB1在酸性条件下稳定，即使加热酸性也稳定；⑶VB1为白色结晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。2.VB1的性质3.维生素B1的测定方法紫外分光光度法:适用于VB1含量高的样品,灵敏度和准确度较差;高效液相色谱法适用于食品中微量VB1的测定荧光法世界各国都用荧光法测定;荧光法是我国国家标准分析方法（GB/T5009.84-2003）⑴原理：硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成一种兰色荧光物质，即为硫色素，在紫外光下，硫色素发出荧光，在一定条件下，其荧光强度与硫色素浓度成正比，即与硫胺素含量成正比。（2）定量方法标准曲线法：配制一系列标准浓度试样测定荧光强度，绘制标准曲线，再在相同条件下测量未知试样的荧光强度，在标准曲线上求出浓度。(3).操作步骤①试样处理样品匀浆（或粉碎）于低温冰箱中冷冻保存。②提取1)水解2)酶解称样三角瓶高压水解盐酸溶液调pH值乙酸钠溶液酶解淀粉酶定容吸附剂采用的是人造浮石。将提取液加入人造浮石交换柱中，VB1被吸附上去，吸附上去后，再用热水淋洗，洗去杂质，最后用热的酸性氯化钾（25%KCl-HAC）把VB1洗脱下来，这样就得到纯VB1。样品热水酸性氯化钾收集酸性氯化钾定容③净化④氧化静置→过滤→脱水反应瓶编号标准A瓶标准B瓶样品A瓶样品B瓶加标准液或样品液标准液5ml标准液5ml样品液5ml样品液5ml加氢氧化钠3ml——3ml——加碱性铁氰化钾——3ml——3ml加正丁醇10ml10ml10ml10ml⑤荧光强度测定(通过荧光分光光度计可以测得)激发波长365nm；发射波长435nm；激发波狭缝5nm；发射波狭缝5nm。（4）方法说明本方法适用于各类食物中硫胺素的测定，但不适用于有吸附硫胺素能力的物质和含有影响硫色素荧光物质的样品；酸解、水解的目的：使结合型的VB1成为游离型的；紫外线会破坏硫色素，所以硫色素形成后，反应瓶要用黑布遮盖或在暗室中进行荧光测定，并且要迅速测定；维生素B2又称核黄素测定方法主要有：微生物法、荧光法、HPLC法GB/T5009.85-2003荧光法（第一法）微生物法（第二法）（三）维生素B2的测定荧光法测维生素B21.原理核黄素在440～500nm波长光照射下发生黄绿色荧光。在稀溶液中其荧光强度与核黄素的浓度成正比。在波长525nm下测定其荧光强度。试液再加入低亚硫酸钠(Na2S2O4)，将核黄素还原为无荧光的物质，然后再测定试液中残余荧光杂质的荧光强度，两者之差即为食品中核黄素所产生的荧光强度。为使VB2游离出来，采用需经酸解和酶解为消除干扰，试样通过氧化处理和柱层析处理。2.测定步骤（1）样品提取称样三角瓶高压水解盐酸溶液调pH值氢氧化钠溶液酶解淀粉酶定容蛋白酶（2）氧化去杂样品提取液具塞试管水双氧水冰乙酸高锰酸钾氧化去杂褪色标准液按相同方法进行（3）柱层析样品液水丙酮-乙酸-水混合液水收集洗脱液定容*标准液按相同操作进行（4）荧光测定激发光波长440nm，发射光波长525nm，测量样品管及标准管的荧光值。待样品及标准的荧光值测量后，在各管的剩余液中加0.1mL20%低亚硫酸钠溶液，立即混匀，在20s内测出各管的荧光值，作为各自的空白值。3.计算X：样品中核黄素含量，mg/100gA：试样荧光值B：试样空白荧光值C：标准荧光值D：标准空白荧光值m：样品质量，gm1：标准管中核黄素含量μgf：稀释倍数100/1000：样品核黄素含量的换算系数1000100)()(1fmDCmBAX维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸;广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。（三）维生素C的测定维生素C具有较强的还原性，对光敏感，氧化后的产物称为脱氢抗坏血酸，仍然具有生理活性；进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。在食品中维生素C就是以还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型这3种形式存在的；食品分析中的所谓总抗坏血酸是指抗坏血酸和脱氢抗坏血酸二者的总量，不包括2，3-二酮古乐糖酸和进一步氧化的产物。维生素C的测定方法测定维生素C的方法有：荧光法，高效液相色谱法，2，4—二硝基苯肼比色法，2，6—二氯靛酚滴定法，等GB/T5009.86—2003《蔬菜、水果及其制品中总抗坏血酸含量测定方法》第一法：荧光法第二法：2，4—二硝基苯肼比色法（1）原理：试样中还原型抗坏血酸经活性炭氧化为脱氢抗坏血酸后，与邻苯二胺反应生成有荧光的喹唔啉，其荧光强度与抗坏血酸的浓度在一定条件下成正比，以此测定食品中抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的总量。注意：脱氢抗坏血酸可与硼酸结合生成复合物，而不与邻苯二胺反应生成荧光物质，由此可以消除杂质的干扰。（空白试验）（第一法）荧光法（测总抗坏血酸）（2）试剂：①偏磷酸—冰醋酸溶液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，加水稀释至500mL过滤后，贮存于冰箱中；②硫酸：0.15mol/L③偏磷酸—乙酸—硫酸溶液：称取15g偏磷酸，加入40mL冰醋酸，用0.015mol·L-1硫酸稀释至500mL；④乙酸钠溶液：称取500g乙酸钠溶解并稀释至1L；⑤硼酸—乙酸钠溶液：称取硼酸9g，加入35mL乙酸钠溶液，用水稀释至1000mL；⑥邻苯二胺溶液：称取