食品中肉毒梭菌的检验

一、生物学特性1、肉毒梭菌肉毒梭菌属于厌氧性梭状芽孢杆菌属，具有该菌的基本特性，即厌氧性的杆状菌，形成芽孢，芽孢比营养体宽，呈梭状，新鲜培养基的革兰氏染色为阳性，产生剧烈细菌外毒素。肉毒梭菌为多形态细菌，约为4×1μm的大杆菌，两侧平行，两端钝圆，直杆状或稍弯曲，芽孢为卵圆形，位于次极端，或偶有位于中央，常见很多游离芽孢。有时形成长丝状或链状，有时能见到舟形、带把柄的柠檬形、蛇样线状、染色较深的球茎状，这些属于退化型。当菌体开始形成芽孢时，常常伴随着自溶现象，可见到阴影。肉毒梭菌具有4~8根周生性鞭毛，运动迟缓，不生荚膜。在固体培养基表面上，形成不正圆形，大约3mm左右的菌落。菌落半透明，表面呈颗粒状，边缘不整齐，界限不明显，向外扩散，呈绒毛网状，常常扩散成菌苔。在血平板上，出现与菌落几乎等大或者较大的溶血环。在乳糖卵黄牛乳平板上的菌落为乳浊，菌落表面及周围形成彩虹薄层，不分解乳糖；分解蛋白的菌株，菌落周围出现透明环。肉毒梭菌发育最适温度为25~35。C,培养基的最适pH为6.0~8.2。肉毒梭菌的生化性状很不规律，即使同种，也常见到株间的差异。如表：各型肉毒梭菌的生化反应型别反应葡萄糖发酵麦芽糖发酵乳糖发酵蔗糖发酵靛基质发酵胆胶液化牛乳消化ABCDEF++-(+-)-(+)+++-(+-)-(+)(+-)+(+-)-(+-)(-)(+-)-+(+-)(-)(+-)(-)(+-)-+(+)-(+-)-(+-)-++-(+-)-(+)(+)注：+阳性反应；-阴性反应；（+-）视菌株而异；（+）多为阳性反应；（-）多为阴性反应根据肉毒毒素的抗原性，肉毒梭菌至今已有A、B、C、(1、2）、D、E、F、G等七个型。引起人群中毒的，主要有A、B、E三型。C、D二型主要是畜、禽肉毒中毒的病原。F、G型肉毒梭菌极少分离，未见G型菌引起人群中毒的报道。案例：肉毒梭菌广泛存在于自然界引起中毒的食品有腊肠、火腿等。在美国以罐头发生中毒较多，日本以鱼制品较多，我国主要以发酵食品有关，如臭豆腐、豆瓣酱等。其它引起中毒的食品还有：烤土豆、炒洋葱等。危害：肉毒梭菌是致死性最高的病原体之一。感染剂量极低，每个人都易感。症状为虚弱、眩晕、伴随视觉模糊等，也会出现腹胀和便秘。毒素最终引起麻痹，呈渐进对称性、自上到下。2、肉毒毒素肉毒梭菌的致病性在于其产生的神经麻痹毒素，即肉毒毒素，而细菌本身则是一种腐生菌。各个型的肉毒梭菌分别产生相应的毒素，所以，肉毒毒素也分为A、B、C、D、E、F、G等七个型。C型包括C1、C2二个亚型。A型毒素经60。C约2min加热，几乎能被完全破坏，而B、E二型毒素要经70。C约2min才能被破坏；C、D二型毒素对热的抵抗更大些；C型毒素要经过90。C约2min加热才能完全破坏，但只要煮沸1min或75。C加热5~10min，毒素都能被完全破坏。肉毒毒素对酸性反应比较稳定，对碱性反应比较敏感。案例：肉毒毒素的毒性极强，是最强的神经麻痹毒素之一，据称，精致毒素1μg的毒力为200000小白鼠（20g）致死量，也就是说，1g毒素能杀死400万t小白鼠，一个人的致死量大概1μg左右。危害：肉毒中毒是由于误食含有肉毒毒素的食品而引起的食物中毒。人的肉毒中毒发生并不多，但是发病急、病程发展快、病死率高。肉毒中毒是毒素型中毒，潜伏期较短，一般为6~36h，最长60h。主要症状有：视力减弱、全身无力、神社和张口困难、抬头费力、瞳孔散大、呼吸麻痹等。重症患者，如果不及时治疗和抗毒素特异治疗，多在2~4天死亡。肉毒中毒一年四季均可发生，发病主要与饮食习惯有着密切关系。二、检验所需器材检验食品中肉毒梭菌一般需要以下培养基和试剂：庖肉培养基、卵黄琼脂培养基、明胶磷酸盐缓冲液、肉毒分型抗毒诊断血清、胰酶（活力1：250）、革兰氏染色液等。检验食品中肉毒梭菌还需要以下设备和器材：离心机及分离管、研体及细砂、培养箱、显微镜、厌氧培养装置（常温催化除氧式或焦性没石子酸除氧式）、1mL和10mL吸管、1mL注射器、平皿、接种环、载玻片、小白鼠等。三、检验程序检样（食品）毒素检测增菌、产毒培养30。C，5天报告（一）毒素检测报告（二）观察生长性状、染色镜检分离培养观察菌落性状，染色镜检增菌产毒培氧30。C，5天毒素检测培养检测报告（三）注：报告一：检样含有某型肉毒毒素报告二：检样含有某型肉毒梭菌报告三：由样品分离的菌株为某型肉毒梭菌四、操作方法肉毒梭菌检验方法的重点乃是产毒及毒素的检出试验，如要正证实是否有肉毒梭菌存在，只要分离、培养、毒素鉴定即可。1、肉毒毒素检测（1）检样制备质检样离心上清液：液状检样可直接离心，固体或半流动检样须加适量（例如等量、倍量或5倍量、10倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后离心，取上清液进行检测。1制胰酶激活处理液：领取一部分上清液，调pH6.2，每9份加10%胰酶（活力1：250）水溶液1份，混匀，经常轻轻搅动，37。C作用60min，进行2肉毒毒素检测以小白鼠腹腔注射法为标准方法。（2）检出实验取上述离心上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠2只，每只0.5mL，观察4天。注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h内发病、死亡。主要症状为竖毛，四肢瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。如遇小鼠猝死以至症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重做实验。（3）确证实验不论上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小鼠发病、死亡者，取样分成3份进行试验，1份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀，37。C作用30min，1份加量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min；1份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀即可，不做其他处理。3份混合液分别注射小白鼠各2只，每只0.5mL，观察4天，若注射加诊断血清与煮沸加热的2份混合液的小白鼠均获保护存活，而惟有注射未经其他处理的混合液的小白鼠以特有症状死亡，则可判定检样中有肉毒毒素存在，必要时要进行毒力测定及定型试验。（4）毒力测定取以判定含有肉毒毒素的检样离心上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成50倍、500倍及5000倍的稀释液，分别注射小白鼠个2只，每只0.5mL，观察4天。根据动物死亡情况计算检样所含肉毒毒素的大体毒力（MLD/mL或MLD/g）。（5）定型试验按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒素的毒力大体在10~1000MLD/mL的范围，分别与各单型肉毒抗诊断血清等量混匀，37。C作用30min，各注射小鼠2只，每只0.5mL，观察4天。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素液等量混合作为对照。能保护动物免于病发、死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。2、肉毒梭菌检验（增菌产毒培养实验）（1）样品处理以无菌操作取检样于灭菌生理盐水中均质。（2）增菌培养取疱肉培养基3支，煮沸10~15min，做如下处理：第一支：急速冷却，接种检样均质液1~2mL;第二支：冷却至60。C，接种检样，继续于60。C保温10min，急速冷却;第三支：接种检样，继续煮沸加热10min，急速冷却。以上接种物于30。C培养5天，若无生长，可在培养十天。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同肉毒毒素检测，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。（3）分离培养选取经毒素检测试验证实含有肉毒梭菌的前述增菌产毒培养物（闭要时可重复一次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35。C厌氧培养48h。典型菌落是隆起或扁平，光滑或粗糙，在卵黄培养基上用斜光检验时菌落表面通常出现虹晕色，此光区称为“珍珠层”，C、D、E型菌通常有2~4mm黄色沉淀区围绕，A、B型菌通常显示较小的沉淀区。根据菌落形态挑取可疑菌落，接种庖肉培养基，于30。C培养5天，进行毒素检测及培养特性性检查确证试验。12毒素检测：试验方法同肉毒毒素检测。培养特性检查：接种卵黄琼脂平板，分成2份，分别在35。C的需氧和厌氧条件下培养48h，观察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只有在厌氧条件下才能在卵黄琼脂平板上生长并形成具有上述特征的菌落，而在需氧条件下则不生长。3、注意事项（1）典型的肉毒中毒，小白鼠会在4~6h内死亡，而且98%~99%的小白鼠会在12h内死亡，因此，试验前24h内的观察是非常重要的。（2）24h后的死亡是可疑的，除非有典型的症状出现。（3）如果小白鼠注射经1：2或1：5倍数稀释的样品后死亡，但注射更高稀释度的样品后未死亡，这也是非常可疑的现象，一般为非常特异性死亡。（4）小白鼠要用不会抹去的颜料加以标记。（5）小白鼠的饲料与水必须及时添加、充分供应。（6）食物中发现毒素，表明未经充分的加热处理，可能引起肉毒中毒。（7）检出肉毒梭菌，但未检出肉毒毒素，不能证明次食物会引起肉毒中毒。（8）肉毒中毒的诊断必须以检出食物中的肉毒毒素为准。（9）中和试验可以为毒素定型。