生物分析化学-核酸

AdvancedBioanalyticalChemistryFall,2015杨朝勇卢嘉锡[e-mail]第二节课核酸分子结构与性质2015年9月28日课件及参考资料下载网址核酸Nucleicacids核酸的化学组成核酸的结构核酸的理化性质核酸的化学合成非天然核酸的结构及性质1868年，Miescher从脓细胞中提取富含磷元素的酸性物质，称为“核素”1889年，Altmann制备不含蛋白质的核酸制品，首先使用了核酸这个名称1944年，Avery等人证实DNA是遗传物质1950年，Chargaff等人确立Chargaff规则1953年，Waston和Crick建立了DNA双螺旋模型1968年，Nirenberg发现遗传密码1975年，Temin和Baltimore发现逆转录酶1981年，Gilbert和Sanger建立DNA测序方法1982/83年，Cech和Altman分别发现了核酶1985年，Mullis发明PCR技术1990年，美国启动人类基因组计划（HGP）1998年，Fire和Mello发现RNA干扰机制2002年，人类基因组计划完成2002年，RonBreaker:Riboswitchdiscovery2012年,Doudna和Charpentier发现CRISPR-Cas9编辑DNA方法（多人）核酸的发现和研究工作进展LandmarkDiscoveriesRNADNAProteinReplication:DNAdirectedDNAsynthesisTranscription:DNAdirectedRNAsynthesisTranslation:RNAdirectedproteinsynthesis1869FriedrichMiescher:DNAdiscovery19531958WatsonandCrick:DNAdoublehelixCrick:CentralDogmaofbiologyNobelprizein1962RibozymeDiscovery19621982OrgelandCrick:FunctionalRNAspeculationCechandAltman:RibozymediscoveryGroupIIntronRibozymeRNasePRNANobelprizein1989InventionofSELEX19851990Szostak,Gold,Joyce:Invitroselection(SELEX)KerryMullis:PCRNobelprizein1993DiscoveryofRiboswitches2002RonBreaker:RiboswitchdiscoveryDiscoveryofCRISPR-Cas92012在原核细胞是核质的成分。在真核细胞，90%以上分布于在细胞核，其余分布于核外如线粒体，叶绿体，质粒等。主要存在于胞液内，真核细胞的核仁和线粒体也含有少量RNA。(deoxyribonucleicacid,DNA)(ribonucleicacid,RNA)脱氧核糖核酸核糖核酸一个生命有机体的每个体细胞（除生殖细胞外）都含有相同质和量的DNA，包含了它的全部遗传信息，决定细胞和个体的基因型(genotype)。RNA的量是变动的。主要有信使RNA(mRNA)，转运RNA(tRNA)和核糖体RNA(rRNA)。参与细胞内DNA遗传信息的表达。某些病毒RNA也可作为遗传信息的载体。核酸的分类及分布DNAschematic(nochemistry)3.Duplexstrandsareantiparallelandcomplementary.Backboneoutside;H-bondedbasesstackedinside.2.DNAstrandsaredirectional1.Nucleotide=sugar-phosphate+base4.ThestrandsformadoublehelixElement:C、H、O、N、PNucleotides:buildingblocksofnucleicacidsNitrogenousbases(pyrimidine&purine)PentosePhosphateNucleotides核苷酸12Pentose13（构成RNA）核糖(ribose)脱氧核糖(deoxyribose)（构成DNA）嘌呤(purine)NNNHN123456789NNNHNNH2腺嘌呤(adenine,A)NNHNHNNH2O鸟嘌呤(guanine,G)NitrogenousbasesNNH132456嘧啶(pyrimidine)胞嘧啶(cytosine,C)NNHNH2O尿嘧啶(uracil,U)NHNHOO胸腺嘧啶(thymine,T)NHNHOOCH3杂环化合物杂环化合物按含杂原子数目可分为含一个、两个或多个杂原子的杂环，按环的形式又可分为单环和稠环两类，单环又可按环的大小分为五元杂环和六元杂环。杂环化合物的命名比较复杂，我国目前主要采用音译法，即按照英文名称的音译，选用同音汉字，再加上“口”字旁表示杂环名称。当杂环有取代基时，以杂环为母体，对环上的原子编号。编号的原则是：从杂原子开始，依次为1，2，3，……，或从杂原子旁的碳原子开始，依次用α，β，γ，……编号，取代基的名称及在环上的位次写在杂环母体名称前。当环上有两个或两个相同的杂原子时，尽可能使杂原子编号最小，如环上不止一个杂原子时，则按O，S，N顺序依次编号，如果其中的一个杂原子上连有氢，应从连有氢的杂原子开始编号。稠杂环的编号，一般和稠环芳烃相同，但有少数稠杂环另有一套编号顺序，如异喹啉、吖啶、嘌呤。核苷：A,G,U,C脱氧核苷：dA,dG,dT,dC碱基和核糖（脱氧核糖）通过糖苷键连接形成核苷（脱氧核苷）。OHOCH2OHOHNNNH2O1´1核苷(ribonucleoside)的结构POOOHOHOCH2OHOHNNNH2OOHOCH2OHOHNNNH2O核苷酸：AMP,GMP,UMP,CMP脱氧核苷酸：dAMP,dGMP,dTMP,dCMP核苷（脱氧核苷）和磷酸以磷酸酯键连接形成核苷酸（脱氧核苷酸）。核苷酸（ribonucleotide）的结构核苷核苷一磷酸核苷二磷酸核苷三磷酸5´端3´端CGA多聚核苷酸•多聚核苷酸是通过核苷酸的3'-OH与另一分子核苷酸的5'-磷酸基形成3',5'-磷酸二酯键(phosphodiester)相连而成的链状聚合物Chainisdirectional.Convention:5’3’.DNADNA分子的大小天然存在的DNA分子最显著的特点是很长，分子质量很大，一般在106-1010。DNA的碱基组成有如下特点：具有种的特异性。没有器官和组织的特异性。在同一种DNA中，A=T、G=C+m5C，即A+G=T+C+mC，即嘌呤碱基的总摩尔数与嘧啶碱基的总摩尔数相等——碱基当量定律又称Chargaff原则。年龄、营养状况、环境的改变不影响DNA的碱基组成。RNAmRNA(信使RNA)：占细胞中RNA总量的3%-5%，分子量大小不一，不稳定，代谢活跃，更新迅速，是合成蛋白质的模板。rRNA(核糖体RNA)：细胞中含量最多的RNA，约占全部RNA的80%,核糖体的组成成分,功能与蛋白质生物合成相关。tRNA(转运RNA)：约占细胞中RNA总量的15%。约由75-90个核苷酸组成。蛋白质合成中携带活化的氨基酸RNA的碱基组成：A、G、C、U,含少量的稀有碱基RNA分子的类型：mRNA、rRNA、tRNA非编码RNAncRNA的功能(1)在RNA修饰加工成熟过程中起作用(2)调节mRN稳定性及其翻译(3)影响蛋白质运输(4)参与机体免疫(5)参与肿瘤发生等疾病过程非编码RNA（Non-codingRNA）是指不编码蛋白质的RNA。其中包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA和microRNA等多种已知功能的RNA，还包括未知功能的RNA。这些RNA的共同特点是都能从基因组上转录而来，但是不翻译成蛋白，在RNA水平上就能行使各自的生物学功能。非编码RNA从长度上来划分可以分为3类：小于50nt，包括microRNA，siRNA，piRNA；50nt到500nt，包括rRNA，tRNA，snRNA，snoRNA，SLRNA，SRPRNA等等；大于500nt，包括长的mRNA-like的非编码RNA，长的不带polyA尾巴的非编码RNA等等。非编码RNA的功能、作用及与其他分子的区别与联系是RNA领域的研究热点•RNA干涉（RNAi）在实验室中是一种强大的实验工具，通过这种方式，利用具有同源性的双链RNA（dsRNA）诱导序列特异的目标基因的沉默，迅速阻断基因活性，可以简化/替代基因敲除。(在2002年度Science评选的10大科学成就中RNAi名列榜首，2006年获诺贝尔生理学和医学奖)•在药物标靶发现和确认方面，RNAi技术已获得了广泛的应用。生物技术公司或制药公司通常利用建立好的RNAi文库来引入细胞，然后通过观察细胞的表型变化来发现具有功能的基因。•在疾病治疗方面，双链小分子RNA或siRNA已被用于临床测试用于几种疾病治疗。在抗病毒治疗方面，帕金森病等神经系统疾病已经开始初步采用RNA干扰疗法。肿瘤治疗方面也已经取得了一些成果。RNAInterference(RNAi)•小的干涉RNA（smallinterferingRNA;siRNA）是在RNA干涉过程中人工体外合成的小片段RNA，由约20个碱基对组成。siRNA在RNA沉默通道中起中心作用，是对特定（特异性强）mRNA进行降解的指导要素。•微小RNA（microRNA;miRNA）是一种21－25nt长的单链小分子RNA，其结构特征如下：广泛存在于真核生物中，是一组不编码蛋白质的短序列RNA，它本身不具有开放阅读框（ORF）；成熟的miRNA，5′端有一个磷酸基团，3′端为羟基，这也是它与相同长度的功能RNA降解片段的区分标志。是由具有发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成，不同于siRNA（双链）但是和siRNA密切相关。•miRNA表达的时序性和组织特异性提示人们miRNA的分布可能决定组织和细胞的功能特异性，也可能参与了复杂的基因调控，对组织的发育起重要作用。siRNA和miRNADicer：RNaseIII核酶家族，可与dsRNA结合，并将其剪切成21～23nt及3'端突出的小分子RNA片段，即siRNA。RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)：RNA诱导沉默复合体，将siRNA解旋成单链，序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。初级miRNAmiRNA前体不完全匹配的dsmiRNA26RNAInterference(RNAi)siRNAmiRNA共同点1．miRNA和siRNA的有效部分都是由22个左右的核苷组成；2．它们都是Dicer酶的产物；3．它们在起干扰、调节作用时都会和RISC复合体结合；4．它们都可以在转录后和翻译水平干扰以抑制靶标基因的翻译；起源阶段通常是外源的，如病毒感染和人工插入的dsRNA被剪切后产生外源基因进入细胞。是内源性的，一种非编码的RNA；由miRNA基因表达出最初的pri-miRNA。成熟过程直接来源是长链的dsRNA；经过Dicer酶切割形成双链siRNA，而且每个前体dsRNA能够被切割成不定数量的siRNA片段。在细胞核中的pri-miRNA经由Drosha酶加工成为单链pre-miRNA；接着，发夹状、部分互补的pre-miRNA在细胞质中被Dicer酶切割成miRNA；生物体中的表达具有时序性、保守性和组织特异性。功能阶段与RISC结合，以RNAi途径行使功能，即通过与序列互补的靶