细胞因子

细胞因子（cytokines）第一节细胞因子概述一、概念细胞因子(cytokine，CK)是由细胞（免疫细胞、非免疫细胞）经刺激而合成、分泌的具有广泛生物活性的小分子蛋白质的统称。免疫细胞：单核－吞噬细胞、T细胞、B细胞和NK细胞非免疫细胞：血管内皮细胞、表皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞也可以产生细胞因子目前已发现200余种人类CK二、细胞因子的共同特性1多数为低分子量的多肽或糖蛋白（1）分子量8～80KD,200aa（2）组成单体大多数，如IL（interleukin）-2、IFN-α二聚体同二聚体：IFN(interferon)-、IL-10异二聚体：IL-12(35KD/40KD)；三聚体TNF(tumornecrosisfactor)(3)多数为单拷贝的基因(IFN-α除外)2多细胞来源性一种CK可由不同类型的细胞产生如IL-1可由单核-吞噬细胞、内皮细胞、B细胞、成纤维细胞、表皮细胞合成和分泌一种细胞可产生多种CK活化的T细胞可产生IL2～6、IL9、10、14；IFN-γ3短暂的自限性分泌Ck一般无前体状态的储存当CK产生细胞受到刺激后，启动CK基因转录，该过程通常十分短暂，且Ck的mRNA极易降解，故CK合成具有自限性。(作用方面特性)4高效性10-12mol/L5主要以自分泌（autocrine）、旁分泌（paracrine）形式发挥效应某些细胞因子（IL-1、IL-6、TNF-α）也可以内分泌（endocrine）形式作用于远端靶细胞,介导全身性反应。某些ck还可以通过细胞内分泌（intracrine），直接与细胞内受体结合。6多效性和重叠性一种ck可以作用不同类型的靶细胞，产生多种生物效应IFN-α除具有抗病毒作用外，还可以抑制成纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞的增殖；另外还可以活化NK细胞。几种不同的ck可作用于同一类靶细胞，产生相同或者相似的生物学效应。IL-4、IL-5、IL-6等均可促进B细胞增殖和分化。Swiss小鼠胚胎成纤维细胞7拮抗性和协同性不同的CK对同一靶细胞功能的影响可相互拮抗.例如IFN-γ可活化巨噬细胞，而IL-4则抑制巨噬细胞功能。协同性：一种CK可强化另一CK的功能.例如，低浓度IFN-γ或TNF单独应用均不能激活巨噬细胞，但联合使用则有显著激活作用。8网络效应CK的产生、生物学作用、受体表达、相互调节等均具有网络性。9CK与激素、神经肽和神经递质共同组成细胞间信号分子系统三、细胞因子的种类白细胞介素interleukins，ILs干扰素interferon，IFN肿瘤坏死因子tumornecrosisfactor，TNF集落刺激因子colonystimulatingfactor，CSF趋化因子chemokines生长因子growthfactor，GF---六大类（按功能分类）转化生长因子－β家族转化生长因子β1、转化生长因子β2、转化生长因子β3骨形成蛋白，生长分化因子激活素与抑制素其它：Nodal蛋白按照产生CK的细胞种类进行分类：淋巴因子（lymphokine）主要由淋巴细胞产生；如IL-2、IL-3、IL-4单核因子（monokine）主要由单核-巨噬细胞产生；如TNF-γ、G-CSF和M-CSF其它主要由血管内皮细胞、上皮细胞、成纤维细胞等产生；如EPO、SCF等stemcellfactor（SCF）干细胞因子即：肥大细胞生长因子mastcellgrowthfactor/MGF促进IL-3依赖的早期造血前体细胞的增殖和分化促进肥大细胞增殖促进黑素母细胞的增殖第二节干扰素(IFN)干扰素（interferon,IFN）干扰素：是由多种细胞（如单核细胞、淋巴细胞）产生的具有广泛的抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的可溶性糖蛋白。其活性发挥受细胞基因组的调节和控制。一、分型(根据其来源、结构及生物学性质)1.I型（抗病毒干扰素）IFN-α、IFN-β（1）分类IFN-α白细胞（主要为单核吞噬细胞）产生分子量19KD多基因产物IFN-β成纤维细胞及白细胞以外的细胞产生分子量20KD单基因产物（2）主要诱生剂：病毒，polyI-C(人工合成双链RNA)（3）受体IFN-α、IFN-β的受体为同一种分子，该基因位于21号染色体，几乎能够在所有有核细胞表面。（4）稳定性对酸稳定，在pH2.0时不被破坏2.II型（免疫干扰素）IFN-（1）主要细胞来源T细胞分子量18kD单基因产物（2）主要诱生剂抗原或有丝分裂原(3)受体基因位于6号染色体;表达在多数有核细胞表面（4）稳定性对酸不稳定，在pH值2.0时极易破坏同一型IFN按照氨基酸序列和组成差异可分为不同的亚型23种α：如IFN-α1、IFN-α2、IFN-α31种β:IFN-β;1种γ:IFN-γ同一亚型又因氨基酸的差异而分为多个亚亚型如：IFN-α1有：IFN-α1a、IFN-α1bIFN-α2有：IFN-α2a、IFN-α2b、IFN-α2c干扰素的型别二干扰素的生物学特性广谱性种属特异性差异性相对稳定性相对安全性IFN的相对稳定性IFN-α、IFN-β对pH和温度比较稳定pH=2的溶液中或60℃放置1h均不失活IFN-γ对pH和温度的稳定性较差pH5时不稳定60℃放置1h失活IFN的毒副作用流感样综合征造血系统改变消化系统反应皮肤反应内分泌系统的影响肾脏损害三、主要生物学活性1.Ⅰ型干扰素（1）抗病毒和抗肿瘤1）诱导宿主细胞产生抗病毒蛋白，干扰病毒复制；2）增强NK细胞对病毒感染细胞和肿瘤细胞的杀伤；3）促进细胞表面MHC（majorhistocopatibilitycomplex）-Ⅰ类分子表达，有助于向CTL(cytotoxicTlymphocyte)细胞提呈抗原，从而实现对病毒感染细胞和肿瘤等靶细胞的杀伤。（2）免疫调节：与Ⅱ型干扰素类似。静止的CTL被靶细胞表面抗原肽-MHCI类分子复合物所活化后，就活化为抗原特异性CTL效应细胞，发挥特异性杀伤靶细胞的功能。主要机制有：分泌穿孔素，穿入靶细胞膜，改变细胞渗透压，导致细胞溶解分泌多种颗粒酶，介导靶细胞凋亡分泌淋巴毒素，直接杀伤靶细胞抗原提呈：是指抗原提呈细胞(antigen-presentingcell，APC)摄取抗原并将其处理成免疫原性多肽，以抗原肽-MHC分子复合物的形式表达于APC表面，供T细胞识别，从而产生免疫应答的过程。抗原提呈？2.Ⅱ型干扰素（1）主要起免疫调节作用1）活化巨噬细胞；2）促进表达MHC-Ⅱ类分子，提高抗原递呈能力；3）促进MHC-Ⅰ类分子表达和增强CTL细胞的杀伤活性;4)增强NK细胞的杀伤活性；5）促进B细胞分化、增殖；（2）抗病毒和抗肿瘤作用(与Ⅰ型干扰素类似)。名称氨基酸数受体产生细胞功能IFN-α166CD118白细胞抗病毒，抗肿瘤，促进MHCI类分子的表达IFN-β166CD118成纤维细胞抗病毒，抗肿瘤，促进MHCI类分子的表达IFN-143CD119T细胞、NK细胞激活巨噬细胞，促进MHCⅡ分子表达和抗原提呈，抑制Th2细胞干扰素摘自MicrobiologyandImmunologyon-line四干扰素的作用分子机制IFN与IFN受体结合IFN信号传导途径，以激活细胞核内IFN相关基因效应蛋白的产生JAK（Janusproteintyrosinekinase）-STAT（signaltransducerandactivatoroftranscription）信号通路为IFN诱导基因表达的主要信号通路IFN的信号转导途径干扰素诱导JAK-STAT复合体核内转移及调节基因转录机制STAT：信号转导子和转录激活子IFN与受体结合后引起受体分子的二聚化与受体偶联的JAK激酶通过交互的Tyr磷酸化作用而活化活化的JAK激酶催化受体Tyr残基磷酸化，并形成STAT分子的“停泊位点”STAT在JAK激酶的作用下实现其C端Tyr残基的磷酸化，并形成同/异聚合体，并离开受体STAT与另外一种DNA结合蛋白形成复合体，进入细胞核，与IFN激活基因的增强子区段相结合，去除抗病毒蛋白基因的转录抑制，相关蛋白得以转录和翻译，从而使靶细胞处于抗病毒状态。PKRPathwaysforIFNmediatedantiviralaction干扰素效应分子五干扰素（抗病毒）生物活性的研究方法原理：用干扰素样品处理易感细胞，使细胞建立抗病毒状态，然后用适当的定量病毒攻击细胞，通过病毒复制的量或病毒引起的细胞病变程度可判断样品中干扰素的生物活性。常用细胞株WISH（人羊膜细胞）、MDBK（牛肾细胞）、L929（小鼠肺纤维瘤）、Hep2/c（人喉癌细胞）要求：易培养,对病毒敏感性高,易于诱导抗病毒状态,对人体无害常用病毒滤泡口炎病毒（vesicularstomatitisvirus,VSV）鼠脑心肌炎病毒（encephalomyocarditis,EMCV）要求:尽可能对人体无害，对靶细胞感染性强，能引起明显的细胞病变。常用体系WISH－VSV体系What’sthemeaningofthecellline?Howtosubculturethecellline?微孔板法测定IFN抑制细胞病变的活性弃培养液,加入待测样品,使细胞建立抗病毒状态接种对数生长期细胞于细胞培养板倍比稀释样品（干扰素）加入病毒液,培养24-48h中性红染色,550nm测定OD值六干扰素的诱生病毒诱生剂dsRNA诱生剂代谢物诱生剂其它无菌接取血液置肝素管中低速离心弃血浆，并补入细胞培养液加入少量IFN-α37℃温浴，以启动诱导加入病毒，温浴37℃离心弃上清液加入细胞培养液37℃培养18-24hIFN-α的诱生离心，取上清液上清液中加入6mol/LHCl，调pH到2.04℃酸化处理用6mol/LNaOH调pH到7.2-7.4离心去沉淀，得粗制干扰素七干扰素类药物按制作方法不同，可分为利用基因工程生产的重组干扰素和自然干扰素两大类。自然干扰素类人体淋巴母细胞多亚型天然干扰素（IFN-N1），葛兰素威康公司（英国）生产，商品名为惠福仁。典型临床药物IFN-α1b针剂溶液剂(滴眼液)IFN-α2a针剂栓剂IFN-α2b针剂IFN-γ针剂IFN-α1b人体白细胞重组干扰素IFNα1b：世界上第一个采用中国人干扰素基因克隆和表达的IFNα1b型干扰素。商品名为赛若金。深圳科兴生物制品有限公司生产，有300万U/支和500万U/支两种剂量特点及理化性质基因位于9号染色体分子量19KD166个氨基酸残基组成白色薄壳状疏松体等电点4.0-6.5最大吸收峰波长278±3nm由含有高效表达人IFNα1b基因的大肠杆菌,经发酵、分离、纯化后制得。稳定性及保存耐酸（pH=2下稳定）热稳定性较好对各种蛋白酶敏感2-8℃避光保存和运输核苷酸序列氨基酸序列(189,23个信号肽)IFN-α2a基因位于9号染色体165个氨基酸分子量19.2±1.92KD等电点5.5-6.8最大吸收峰波长278nm±3nm白色薄壳状疏松体由含有高效表达的人IFNα1b基因的大肠杆菌、酿酒酵母,经发发酵、分离、纯化后制得。如何获得各种蛋白的核酸和蛋白序列？13829二硫键198二硫键IFN-α2a165个氨基酸临床上常用的IFN-α2a罗氏公司（瑞士）生产的罗扰素，有300万U/支和450万U/支两种剂量，粉剂和水剂两种剂型；沈阳三生公司生产的因特芬，每支300万U辽宁卫星生物研究所生产的迪恩安，每支300万U和500万U两种剂型，均为粉剂，但备有专用溶解液。IFN-α2b基因位于9号染色体165个氨基酸分子量19.2±1.92KD等电点4.0-6.7最大吸收峰波长278nm±3nm白色薄壳状疏松体，加入标示量注射用水后应迅速复溶为澄明液体由含有高效表达人IFNα2b基因的大肠杆菌、腐生型假单孢菌,经发酵、分离、纯化后制得。重组人IFN-α2b165个aaIFN-α2a23位为Lys；IFN-α2b23位为精氨酸IF