已知基因序列获取方法

已知基因序列的获取策略——兼谈引物设计与序列分析黄钢第三军医大学遗传教研室2006.11.1.获取序列信息，设计合适的引物选取相应的组织或细胞，提取RNA并RTPCR扩增获得全长cDNA装入合适的克隆或表达载体，菌落PCR、酶切与测序证实根据需要进一步进行亚克隆RNaseH消化（可选）一、如何获取已知目的基因的序列信息先查找其蛋白相关信息,了解该基因编码产物的基本情况与功能（）进一步查找其核酸相关序列信息，常用数据库：Genebank、EBI、DDBJ二、目的基因cDNA序列的获取方法cDNA文库扫描RT-PCR人工合成组织RNA的提取在匀浆器中加工冷冻的组织通过注射器加工冷冻的组织在液氮中将组织研磨成粉末在液氮中研磨组织至粉末状，细胞裂解更完全，产量比前二者多一倍。合适的RNA提取方法加上合适的组织处理方法，才能够获得最佳的提取效果RNA提取两要素忌讳贪多：不能指望1mlTrizol提取100mg以上组织，一般50mg用1mlTrizol较合适速战速决：尽量缩短提取时间，不要完全照搬Protocol,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的话，可以立即加入氯仿，立即离心，14000rpm离心10min,取完上清加入0.6~1体积的异丙醇，立即高速离心（14,000rpm,5min），.....总之尽量快速！尽量减少RNAase污染RNase的危害主要集中在将RNApellet溶解在水中之后，防止RNA降解的重点应当放在组织样本的保存和RNA水溶液的保存上。注意实验前的准备工作：各种器材的去RNAase处理与无RNAase的准备。长期保存RNA时建议用去离子甲酰胺溶解总RNA沉淀如何确认RNA的质量RNA的电泳图谱检测RNA溶液的吸光度保温试验荧光染色、毛细管电泳和Agilent2100生物分析仪分析28S18S5SRT引物的选用GSP：适合序列肯定的模板，常用于一步法RT－PCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在扩增低丰度的转录本时是最好的。OligodT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录；随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA片段的逆转录。RT中提高合成全长cDNA的效率消除mRNA二级结构：逆转录之前将RT引物与RNA模板进行短暂的热变性,可破坏mRNA二级结构,促进锚定引物与模板的正确配对。选用RNaseH灭活改造的新型耐高温逆转录酶：Thermoscript、SuperscriptⅢ等，RT后建议进行RNaseH消化处理。锚定RT引物的选用：5'–(T)25VN–3‘热启动RT有条件者选用Tricine-EDTABuffer溶解cDNA10mMTricine-KOH(pH8.5)1.0mMEDTA小于5微克可自己找公司合成建议用热盖PCR仪或空气浴孵箱保温建议选用RNaseH消化高保真DNA多聚酶的选用常用高保真DNA多聚酶：如Pfu、DeepVent、Vent、Pwo、KOD、Pyrobest、PrimerStar等PCR过程中HotStart与Touchdown的使用高保真DNA多聚酶与普通rTaq的混合使用PCR产物加A尾进行T-A克隆：循环即将结束时加入rTaq5U72℃保温20～30min两步变温法PCR载体构建中的常见问题利用单酶切位点将片段插入载体双酶切中的问题对过长cDNA片段:可分段扩增，再利用RE位点或重叠延伸融合成全长cDNA酶切位点甲基化的问题ClaIG6mATCGATXbaITCTAG6mATC真核表达载体的选择PromoterConventional/Tissue-Specific/InduciblePoly(A)tailKozak序列：－9GCCGCCA/GCCAUGG＋4一个载体内的多基因表达IRES系统加linker直接融合表达多个独立的表达cassettes：优于共转染表达SOE技术与基因人工合成及多基因融合基因设计与人工合成中的密码子优化DNAWorks2.4(Hoover,D.andLubkowski,J.,2002)：Splicedbyoverlappingextension搭桥技术融合基因三、引物设计引物设计的3条基本原则：引物与模板的序列要紧密互补引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应(即错配)。引物设计注意事项引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不应大于38bp。引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。5’端序列的修饰与标记：可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5‘端限制酶位点外再加1-3个保护碱基。简并引物：应选用简并程度低的密码子,例如选用只有一种密码子的Met,3’端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。同源性或互补性：两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性。GC含量：一般为40-60%。另外，上下游引物的GC含量不能相差太大。Tm值：引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。有多种计算方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在软件中常使用的是最邻近法(thenearestneighbormethod)。△G值：指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端△G值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间△G值相对较高的引物。引物的3’端的△G值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。PrimerPremier5.0引物设计限制性内切酶位点分析DNA基元(motif)查找同源性分析GenetoolV2.0Oligo6.69四、测序图比对、拼接与虚拟克隆(insilicocloning)常用本地软件：Clonemanager、VectorNTI、DNAstar和ds-Gene等在线工具：BLAST等常用序列拼接软件DNAstar的SeqMan模块VectorNTI程序的ContigExpress模块Sequencher开始→所有程序→DNAstar→SeqMan新的拼接任务添加序列打开保存序列的文件夹选择序列导入整理一下末端用鼠标拖动手动更改末端用鼠标点击更改序列方向和形式选择载体自动查找拼接看看结果点开测序图6种阅读框选择的序列的位置NCBI查询所选择的序列保存结果打印成PDF文件也是一个不错的选择运行VNTI程序ContigExpress程序窗口，可以设定参数，一般用默认值即可。导入测序结果（文件扩展名ab1改成abi）相关软件EditViewforMacs；ChromaforWindows]也可以用鼠标右键导入后可以双击查看和编辑各个测序结果选择序列，根据实际情况调整序列末端选择序列拼接双击查看结果输出结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧。开始→所有程序导入序列选择序列此界面调整参数详细说明拼接双击查看结果输出结果