第十章胚胎干细胞的培养

第十章胚胎干细胞的培养能在体外增殖又具有胚胎细胞全能性或多能性的，并通过适当条件能被诱导分化为各种类型分化细胞的实验模型。20世纪70年代，胚胎性瘤细胞（EC细胞）是畸胎瘤干细胞，具有恶性生长并显示类似于胚胎细胞发育的全能或多能的性质。80年代初，从小鼠早期胚胎的内细胞团或桑椹胚分离建立了具有发育全能性的胚胎干细胞（ES细胞）。近年,多能性胚胎生殖细胞系（EG细胞），被称为“干细胞之母”。一、ES细胞和EG细胞培养和建系的基本技术（一）饲养层细胞不论ES细胞或EG细胞，原代或初代培养阶段一般都须依赖于能分泌它们在体外存活增殖所必需生长因子的饲养层细胞。保持活性但不分裂增殖1MEF细胞小鼠胚胎成纤维细胞2STO细胞来自于SIM小鼠胚胎的硫代鸟嘌呤和乌本苷有抗性的成纤维细胞系。二、胚胎细胞的来源采用超排途径1主要材料动物：雌雄小鼠激素：PMS、HCG2获取胚胎的过程（1）雌鼠，5IUPMS，48h后5IUHCG（2）雌雄合笼，自然交配，次晨查阴道栓为交配后0.5d（即0.5dpc）。（3）3-4d，分别剖取子宫，冲出子宫内桑椹胚和早期胚泡进一步分离培养ES细胞。8.5-10.5dpc时的胚胎生殖嵴可建立EG细胞系。（三）ES和EG细胞的培养过程1ES细胞培养基本培养液为含15-20%FCS，0.1mmol/l，β-巯基乙醇和50IU/ml青霉素，50ug/ml链霉素的MEM培养液。接种桑椹胚和胚泡于预先铺有作为饲养层无有丝分裂活性的单层MEF细胞的35mm培养皿中，培养2-3d然后按下列方法分离ICM细胞，进一步培养。方法一，免疫手术法：1）取出10只左右上述体外培养的胚泡，放在小培养皿中，用酸性Tyrode液（PH2.5）处理1-2分钟，去除透明带。2）胚泡移入Hanks液的小培养皿中洗涤一次。直接露于经培养液1:2000稀释的兔抗JCR小鼠脾脏细胞抗血清（抗H-2b）。3）30分钟后，再移到用培养液1:6稀释的新鲜豚鼠血清中,处理30min左右胚泡的滋养层细胞呈泡状，发生免疫溶解，而ICM细胞不具有H-2b抗原，不发生细胞免疫溶解，故完整无损。方法二、常规培养：桑椹胚或胚泡不需要透明带1)在铺有饲养层的MEM基本培养液中培养3-4天，ICM细胞团从贴壁胚泡内长出来。2）吸出ICM细胞团，0.25%(w/v)胰蛋白酶和0.2mmol/l混合消化液在37℃消化5分钟。3)部分解离的细胞团移至铺有MEF饲养层的培养板培养4天,可在一些孔内见到巢状胚胎干细胞团。4)胰蛋白酶消化巢状胚胎干细胞团并继续培养，一般4-5天间隔用胰蛋白酶消化，克隆和纯化ES细胞，视ES细胞巢密度转移到较大容积的培养皿或培养瓶。2EG细胞EG细胞建系基本过程如下：1）原始生殖细胞分离和原代培养（1）收集8.5-10.5dpc胚胎，清洗，取生殖嵴组织。（2）0.02%EDTA液孵育，37℃，15min。（3）吹散，接种。2）饲养层细胞：宜用8代以内的小鼠MEF细胞或STO细胞系。（1）用前经10ug/ml丝裂霉素C处理2-3h。（2）接种3）EG细胞纯化和建系（1）分裂增殖，4-6d后，解剖镜下胰酶消化，转移继续培养。（2）从复上面2-3次，可产生巢状干细胞群落。（3）最后转移进一步扩增，此时可省LIF，SCF，bFCF等生长因子。（4）EG细胞传代、冻存和复苏：常规胰蛋白酶消化法传代，无饲养层细胞要加LIF。冻存与复苏常规方法。二、ES细胞体外诱导•在特定的培养条件和诱导剂共同作用下，ES细胞可分化形成各种类型的细胞。•EG细胞和ES细胞有类似的发育全能性，但用于细胞诱导分化的成熟资料不多。