转录因子基因Mfhb-1的表达对苜蓿体细胞胚胎发生过程中营养元素含量的影响

转录因子基因Mfhb-1的表达对苜蓿体细胞胚胎发生过程中营养元素含量的影响摘要：ｍｆｈｂ－１基因是在苜蓿体细胞胚胎发生诱导早期经扣除杂交得到的ｈｄ－ｚｉｐⅰ类转录因子基因，相关研究表明，ｍｆｈｂ－１基因在苜蓿体细胞胚胎发生诱导的早期可能发挥重要作用。为了进一步探讨ｍｆｈｂ－１基因的生物学功能与营养元素吸收的关系，试验以经２，４－ｄ诱导的苜蓿幼嫩叶片的叶肉细胞为材料，利用电感耦合等离子体发射光谱技术，对ｍｆｈｂ－１基因的正义、反义转化植株体细胞胚胎发生发育过程中的１０种营养元素含量进行了测定。结果显示，ｍｆｈｂ－１基因的表达可能在苜蓿体细胞胚胎发生诱导初期促进了对ｎａ元素的吸收，同时抑制了对ｍｇ、ｚｎ元素的吸收；ｃｕ、ｋ、ｆｅ、ｍｎ等元素的含量变化可能受ｍｆｈｂ－１基因表达的影响较小。不过ｍｆｈｂ－１基因表达与营养元素吸收的关系，以及进而如何影响苜蓿体细胞胚胎发生的详细分子作用机理等有待于进一步研究。关键词：苜蓿；ｍｆｈｂ－１基因；ｈｄ－ｚｉｐ转录因子；体细胞胚胎；营养元素；电感耦合等离子体发射光谱技术ｅｆｆｅｃｔｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅｍｆｈｂ－１ｏｎｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｎｕｔｒｉｅｎｔｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｔｈｅｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｍｅｄｉｃａｇｏｆａｌｃａｔａｚｈｏｕｙａｎ１，ｈｅｎａｎ－ｎａｎ１，２，ｗｅｉｑｉ－ｃｈａｏ１，ｚｈａｎｇｓｈｅｎｇ－ｌｉ１，ｘｕｅｘｉａｏ－ｆｅｎｇ１，ｚｈａｏｊｕｎ－ｊｉｅ１（１．ｓｃｈｏｏｌｏｆｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｈｅｎａｎｉｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆｓｃｉｅｎｃｅａｎｄｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｘｉｎｘｉａｎｇ４５３００３，ｈｅｎａｎ，ｃｈｉｎａ；２．ｈｏｎｇｑｉｆａｒｍｏｆｔｈｅｓｉｘｔｈａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌｄｉｖｉｓｉｏｎ，ｘｉｎｊｉａｎｇｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎｃｒｏｐｓ，ｃｈａｎｇｊｉ８３１７０２，ｘｉｎｊｉａｎｇ，ｃｈｉｎａ）ａｂｓｔｒａｃｔ：ｔｈｅｇｅｎｅｎａｍｅｄｍｆｈｂ－１ｗｈｉｃｈｗａｓｉｓｏｌａｔｅｄｄｕｒｉｎｇｔｈｅｉｎｄｕｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｅａｒｌｙｓｔａｇｅｓｏｆｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｍｅｄｉｃａｇｏｆａｌｃａｔａｌ．ｂｙｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｃｄｎａｃｌｏｎｉｎｇｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏａｋｉｎｄｏｆｈｄ－ｚｉｐｉｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒｇｅｎｅ．ｒｅｌｅｖａｎｔｓｔｕｄｉｅｓｈａｄｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔｔｈｅｍｆｈｂ－１ｇｅｎｅｃｌｏｓｅｌｙａｓｓｏｃｉａｔｅｄｔｏｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｍ．ｆａｌｃａｔａ．ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｙｏｕｎｇｌｅａｆｃｅｌｌｆｒｏｍｓｅｎｓｅａｎｄａｎｔｉｓｅｎｓｅｔｒａｎｓｇｅｎｉｃｐｌａｎｔｓｗｉｔｈｍｆｈｂ－１ｇｅｎｅｗａｓｉｎｄｕｃｔｅｄｂｙ２，４－ｄｔｏｐｒｏｃｅｓｓｔｈｅｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓ，１０ｋｉｎｄｓｏｆｎｕｔｒｉｅｎｔｅｌｅｍｅｎｔｓｗｅｒｅｓｕｒｖｅｙｅｄｂｙｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙｃｏｕｐｌｅｄｐｌａｓｍａｅｍｉｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ（ｉｃｐ－ａｅｓ）ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｆｈｂ－１ｇｅｎｅｍｏｓｔｌｉｋｅｌｙｐｒｏｍｏｔｅｄｔｈｅｉｎｃｒｅａｓｅｏｆｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｎａｅｌｅｍｅｎｔｓｗｈｉｌｅｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｍｇ，ｚｎｅｌｅｍｅｎｔｄｕｒｉｎｇｔｈｅｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏｇｅｎｅｓｉｓｉｎｍ．ｆａｌｃａｔａ；aｌｔｅｒｎａｔｉｖｅｌｙ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｆｈｂ－１ｈａｄｎｏｔｓｈｏｗｅｄａｎｏｂｖｉｏｕｓｉｍｐａｃｔｏｎｔｈｅｃｈａｎｇｅｏｆｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｃｕ，ｋ，ｆｅａｎｄｍｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｙｗｏｕｌｄｂｅｒｅｑｕｉｒｅｄｔｏｉｌｌｕｓｔｒａｔｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍｆｈｂ－１ｇｅｎｅａｎｄｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆｎｕｔｒｉｅｎｔｅｌｅｍｅｎｔｓｓｏｔｈａｔｔｏｔａｋｅａｓｔｅｐｌｅａｄｉｎｇｔｏｒｅｖｅａｌｔｈｅｉｎｓｉｇｈｔｏｆｔｈｅｄｅｔａｉｌｅｄｍｏｌｅｃｕｌａｒｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｔｈｅｍｆｈｂ－１ｇｅｎｅ．ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｍｅｄｉｃａｇｏｆａｌｃａｔａｌ．；ｍｆｈｂ－１ｇｅｎｅ；ｈｄ－ｚｉｐｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｆａｃｔｏｒ；ｓｏｍａｔｉｃｅｍｂｒｙｏ；ｎｕｔｒｉｅｎｔｅｌｅｍｅｎｔ；ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙｃｏｕｐｌｅｄｐｌａｓｍａｅｍｉｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ苜蓿（ｍｅｄｉｃａｇｏｆａｌｃａｔａｌ．）是研究植物体细胞胚胎发生的典型模式植物之一，ｍｆｈｂ－１基因是在苜蓿体细胞胚胎发生诱导早期，经扣除杂交得到的同源异型域——亮氨酸拉链蛋白（hemeodomainleuzinezipper，hd-zip）ⅰ类转录因子基因。为了研究该基因的生物学功能，在前期利用正义、反义转化技术将该基因导入到了苜蓿中，并已得到该基因过量表达和低量表达的转化植株［１，２］。转录因子对各种功能基因的调控作用可能受到光照、植物激素、低温等逆境条件的影响。营养元素是植物体内一系列生理生化反应的关键辅助因子，因而在参与调控植物早期生长发育及其植物形态构建的过程中发挥着重要作用。前期研究结果显示，基因的表达可能与苜蓿体细胞胚胎发生过程密切相关［１］，但具体的分子机理尚不清楚。本研究利用电感耦合等离子体发射光谱（ｉｎｄｕｃｔｉｖｅｌｙｃｏｕｐｌｅｄｐｌａｓｍａｅｍｉｓｓｉｏｎｓｐｅｃｔｒｏｓｃｏｐｙ，ｉｃｐ－ａｅｓ）法检测ｍｆｈｂ－１基因正义、反义转化植株体细胞胚胎发生过程中的１０种营养元素含量，以探讨ｍｆｈｂ－１的过量表达或低量表达对苜蓿体细胞胚胎发生过程中营养元素的吸收产生的影响，从而确定在苜蓿体细胞胚胎发生过程中该基因表达与营养元素含量变化的关系，进而为全面揭示ｍｆｈｂ－１基因作用的分子机理提供相关的研究方法和理论依据。１材料与方法１．１植物材料试验所用的苜蓿材料共有４种，分别是４７／１－５、ｄ３、ｆ４、ｃ５；其中４７／１－５为苜蓿未转化的材料，作为试验的对照；ｄ３、ｆ４和ｃ５是以４７／１－５为起始材料经转化得到的转化体，ｄ３为携带ｍｆｈｂ－１基因编码区反向序列的反义转化植株；ｆ４为携带ｍｆｈｂ－１基因编码区序列的正义转化植株；ｃ５为携带全长ｍｆｈｂ－１基因，包括编码区以及该编码区上游的保守序列开放阅读框（upstreamopenreadingframes，uorf）序列的正义转化植株。４种苜蓿材料均在ｍｓ固体培养基、２２℃、光照时间１６ｈ／ｄ的条件下进行试验材料的扩大培养。参照ｄｅｎｃｈｅｖ等建立的的苜蓿直接体细胞胚胎发生体系［３］，取培养８～１２ｄ的植株，剪下靠近顶端的叶片约１２片，在含有少许ｂ５ｏ培养基的培养皿里切成小块，然后吸出液体，把切碎的叶片转入含有４０ｍｌｂ５ⅳ（２，４－ｄ４．０ｍｇ／ｍｌ）培养基的１００ｍｌ三角瓶里，进行液体悬浮振荡培养，直接诱导其体细胞胚胎发生，诱导时间为１８ｄ。然后转入ｂ５／３ｍ培养基中，使前期叶肉细胞悬浮培养物继续发育，每１０ｄ更换培养基一次，共发育培养３０ｄ。培养条件为温度２２℃、光照时间１６～1８ｈ／ｄ、转速为１２０ｒ／ｍｉｎ。在苜蓿体细胞胚胎发生诱导培养的开始、第五天、第十天、第十五天、第十八天和发育培养的第十天、第二十天、第三十天分别取材，并称取１ｇ培养物，３次重复，经液氮速冻后放入超低温冰箱（－８０℃）中保存，待用。将材料从超低温冰箱中取出后放入烘箱中，１０５℃杀青３ｈ，８０℃烘干至恒重，转移至瓷坩埚中，用马弗炉２００℃炭化１ｈ、４００℃灰化３ｈ，至灰化完全（无黑色颗粒）后取出冷却，加３ｍｌｈｃｌ－ｈｃｌｏ４（４∶１，体积比）混合液混匀，在电阻板上加热至完全溶解，定容至１０ｍｌ。１．２ｍｆｈｂ－１基因结构ｍｆｈｂ－１基因正义与反义结构如图１所示，在图１中，ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ２为携带ｍｆｈｂ－１基因编码区上游的开放阅读框（ｕｏｒｆ）序列；ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ３为ｍｆｈｂ－１基因反义编码区，ｄ３植株携带该片段；ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ４为ｍｆｈｂ－１基因正义编码区（ｃｄｓ），ｆ４植株携带该片段；ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ５为ｍｆｈｂ－１基因全长序列（开放阅读框＋编码区序列），ｃ５植株携带该片段。１．３主要试剂与设备ｈｃｌ、ｈｃｌｏ４、ｈｎｏ３均为分析纯，由天津德恩化学试剂有限公司生产；试验用水均为超纯水，由德国ｓｇ公司ｕｌｔｒａｃｌｅａｒｕｖｐｌｕｓ超纯水机现制现用。使用ｏｐｔｉｍａ２１００ｄｖ电感耦合等离子体原子发射光谱仪（美国ｐｅｒｋｉｎｅｌｍｅｒ公司），垂直观测，观察位置自动优化；双阵列背投式固态ｃｃｄ检测器光学系统、ｒｙｔｏｎ材料雾化器、内置式三通道蠕动泵、４０．６８ｍｈｚ自激式固态高频发生器、空气切割消除尾焰技术系统、ｐｏｌｙｓｃｉｅｎｃｅ循环水冷却系统等均为实验室原已具备的仪器。营养元素标准溶液储备液为ｃｕ、ｆｅ、ｚｎ、ｍｎ、ｎａ、ｋ、ｃａ、ｍｇ、ｓｅ、ｃｏ混合标准液，浓度均为１０００μｇ／ｍｌ（德国默克公司）。将标准储备液用体积分数为２％的ｈｎｏ３逐级稀释，ｃｕ、ｆｅ、ｚｎ、ｍｎ、ｎａ、ｋ、ｃａ、ｍｇ、ｓｅ、ｃｏ等混合标准液按０．００、０．５０、１．００、２．００、４．００、８．００μｇ／ｍｌ梯度进行配制。１．４ｉｃｐ－ａｅｓ工作参数用ｉｃｐ－ａｅｓ检测样品溶解液中ｃｕ、ｆｅ、ｚｎ、ｍｎ、ｎａ、ｋ、ｃａ、ｍｇ、ｓｅ、ｃｏ的离子浓度，ｉｃｐ－ａｅｓ仪器工作参数分别是工作功率１．３ｋｗ、辅助气体流量０．２ｌ／ｍｉｎ、冷却气体流量１５．０ｌ／ｍｉｎ、载气０．８ｌ／ｍｉｎ、进样泵流量１．５ｌ／ｍｉｎ，２结果与分析２．１分析波长的选择及背景的校正ｉｃｐ－ａｅｓ法对每种营养元素的测定都可以同时选择多条特征谱线，且具有同步背景校正功能。因此，试验过程中对每种检测营养元素同时选取２～３条谱线进行测定，综合分析强度、干扰情况及稳定性，选择谱线干扰少、精密度高的分析线。各营养元素的分析波长选择结果分别是ｃｕ３２４．７５ｎｍ、ｆｅ２５９．９３ｎｍ、ｚｎ２１３．８５ｎｍ、ｍｎ２５７．６１ｎｍ、ｎａ５８９．５９ｎｍ、ｋ７６６．４９ｎｍ、ｃａ３１７．９３ｎｍ、ｍｇ２７９．０７ｎｍ、ｓｅ１９６．０２ｎｍ、ｃｏ２２８．８５ｎｍ。２．２回归方程和相关系数按选择的工作条件检测各营养元素在配制好的系列梯度浓度的标准品混合溶液下的峰面积，用峰面积（ｙ）对标准液浓度（ｘ，μｇ／ｍｌ）绘制标准工作曲线。各营养元素的线性方程和相关系数见表１。２．３样品测定结果经ｉｃｐ－ａｅｓ检测，４种苜蓿材料中ｃｏ元素和ｓｅ元素含量的测定结果为负值，低于系统检出限；其他８种营养元素的测定结果见图２，其中图２ａ为ｃａ元素的含量动态变化，图２ｂ为ｍｇ元素的含量动态变化，图２ｃ为ｎａ元素的含量动态变化，图２ｄ为ｚｎ元素的含量动态变化，图２ｅ为ｃｕ元素的含量动态变化，图２ｆ为ｋ元素的含量动态变化，图２ｇ为ｆｅ元素的含量动态变化，图２ｈ为ｍｎ元素的含量动态变化。由４种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中各营养元素含量动态变化可以看出，ｃａ元素在４种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中均表现出先下降后上升再下降并保持平稳的变化趋势，在诱导培养阶段的第五天，４种苜蓿材料的ｃａ元素含量由高到低表现为ｆ４、４７／１－５、ｃ５、ｄ３；在诱导培养后期（１８ｄ），ｃ５和ｆ４的ｃａ元素含量上升，ｄ３和４７／１－５的ｃａ元素含量保持平稳的态势。ｍｇ元素含量在４种苜蓿材料体细胞胚胎发生发育过程中的动态变化较为复杂。在体胚诱导培养阶段内，除４７／１－５表现出先下降后上升的趋势外，ｄ３、ｆ４和ｃ５均表现出先上升后下降的变化，而ｄ３的峰值在诱导培养阶段的第十天出现，早于ｃ５的第十五天，也早于f4的发育培养阶段第十天