1.2 基因工程的基本操作程序课件

新课导入外星来客？？？虎蚕白斑马普通玉米有抗虫基因的玉米1.2基因工程的基本操作程序教学目标知识目标简述基因工程的原理和技术。1、通过对书中插图、照片等的观察，学会科学的观察方法，培养观察能力。能力目标2、通过举一反三，掌握基因工程操作过程，养学生对相关知识的理解能力及良好的语言表达能力。情感态度与价值观通过引导学生在网上的探究活动，引导学生主动参与，乐于探究，培养学生收集和处理科学信息的能力、获取新知识的能力、分析和解决问题的能力及交流与合作的能力。重点难点教学重难点基因工程的基本操作程序的四个步骤。从基因文库中获取目的基因。利用PCR技术扩增目的基因。基因工程的基本操作程序一目的基因的获取二基因表达载体的构建三将目的基因导入受体细胞四目的基因的检测与鉴定一、目的基因的获取供体生物细胞取出DNA用限制酶剪去多余部分目的基因将需要的基因从供体生物细胞内提取出来即：（1）定义：目的基因主要是指_______________的基因。需要转移或改造（2）常用种类：目前被广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、植物抗病基因（抗病毒、抗细菌)、种子贮藏蛋白的基因、人胰岛素基因、干扰素基因等。（3）获得目的基因的方法：1、从基因文库中获取目的基因2、人工合成的方法3、利用PCR技术扩增目的基因1.1什么是基因文库将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，成为基因文库。1.2基因文库的种类基因组文库：部分基因文库(cDNA文库)：含有一种生物的全部基因含有一种生物的部分基因1、从基因文库中获取目的基因1.3基因文库的构建提取某种生物的全部DNA用适当的限制酶切一定大小的DNA片段将DNA片段与载体连接导入受体菌中储存基因组文库某种生物的mRNA单链互补DNA双链cDNA片段导入受体菌中储存与载体连接cDNA文库逆转录构建基因组文库构建部分基因文库1.4怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因根据目的基因的有关信息，如根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因的表达产物蛋白质的特性来获取目的基因。2、人工合成的方法2.1反转录法：目的基因的mRNA单链DNA(cDNA）双链DNA(即目的基因)反转录合成以目的基因转录成的信使RNA为模板，反转录成互补的单链DNA，然后在酶的作用下合成双链DNA，从而获得所需的基因。2.2根据已知的氨基酸序列合成DNA法：蛋白质的氨基酸序列mRNA的核苷酸序列结构基因的核苷酸序列目的基因推测化学合成推测3、利用PCR技术扩增目的基因3.1PCR技术(聚合酶链式反应)原理：DNA双链复制的基本原理。3.2PCR技术反应前提：PCR扩增仪一段已知目的基因的核苷酸序列，根据这一序列合成引物。引物？一小段单链DNA或RNA，一般20～30个碱基，能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。四种脱氧核苷酸一对引物热稳定DNA聚合酶(Taq酶）DNA的两条链为模板温度控制和缓冲液3.2PCR技术反应条件：5/3/G—GT—C3/5/G—AC—C5/3/引物ⅡG—G复性延伸5/3/A—G引物Ⅰ目的基因DNA受热解成单链变性引物与单链互补结合合成链受DNA聚合酶的作用3.3PCR技术反应过程：载体的作用：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能够表达和发挥作用。a、目的基因b、启动子c、终止子d、标记基因（2）基因表达载体的组成：有人采用总DNA注射法进行遗传转化，即将一个生物中的总DNA提取出来，通过注射或花粉管通道法导入受体植物，没有进行表达载体的构建，这种方法针对性差，完全靠运气，也无法确定什么基因导入了受体植物。此法目前争议颇多，严格来讲不算基因工程。将目的基因直接导入受体细胞不是更简便吗？如果这么做，结果会怎样？科学家在培育抗虫棉时，经过了许多复杂的过程和不懈的努力，才获得成功。起初把苏云金芽孢杆菌的抗虫基因插入载体质粒中，然后导入棉花的受精卵中，结果抗虫基因在棉花体内没有表达。然后在插入抗虫基因的质粒中插入启动子(抗虫基因首端)，导入棉花受精卵，长成的棉花植株还是没有抗虫能力。科学家又在有启动子、抗虫基因的质粒中插入终止子(抗虫基因末端)，导入棉花受精卵，结果成长的植株，有了抗虫能力。精彩源于发现三、将目的基因导入受体细胞（1）常用的受体细胞：动植物细胞、大肠杆菌、土壤农杆菌、枯草杆菌等。（2）将目的基因导入受体细胞的原理：借鉴细菌或病毒侵染细胞的途径。转化目的基因进入受体细胞内，并且在受体细胞内维持稳定和表达的过程。导入植物细胞导入动物细胞导入微生物细胞农杆菌转化法基因枪法花粉管通道法显微注射法感受态细胞吸收DNA分子（3）将目的基因导入受体细胞的方法：3.1导入植物细胞农杆菌特点：易感染双子叶植物和裸子植物。Ti质粒的T-DNA可转移至受体细胞的染色体上。农杆菌转化法农杆菌转化法示意图目的基因的遗传特性得以维持稳定和表达目的基因插入Ti质粒的T-DNA上农杆菌导入植物细胞整合到受体细胞的染色体上农杆菌转化法花粉管通道法基因枪法提纯含目的基因的表达载体取出卵细胞显微注射受精卵移植入输卵管或子宫发育成具新性状的动物3.2导入动物细胞显微注射技术将目的基因导入动物细胞原核生物繁殖快、多为单细胞、遗传物质相对较少，故早期常作为受体细胞。大肠杆菌细胞用Ca2+处理感受态细胞重组表达载体DNA溶于缓冲液混合转入3.3导入微生物细胞①检测转基因生物染色体的DNA上是否插入了目的基因②检测目的基因是否转录出了mRNA③检测目的基因是否翻译成蛋白质抗虫鉴定、抗病鉴定、活性鉴定等方法——方法——方法——DNA分子杂交分子杂交抗原-抗体杂交四、目的基因的检测与鉴定分子检测个体鉴定没有抗虫基因的棉植株有抗虫基因的棉植株棉铃虫虫没有死虫被杀死没有表达基因表达若不能表达，要对抗虫基因再进行修饰。棉铃虫无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。课堂小结目的基因的获取获取能编码某种蛋白质结构基因基因表达载体的构建使目的基因在受体细胞中稳定存在，并可以遗传给下代，使目的基因能够表达目的基因导入受体细胞是目的基因进入受体细胞并在细胞内维持稳定和表达的过程目的基因的检测和鉴定检测目的基因检测目的基因是否转录，并翻译成蛋白质。1、PCR技术扩增过程:①DNA变性（90℃-95℃）：双链DNA模板在热作用下，______断裂，形成_______。②复性（55℃-60℃）：系统温度降低，引物与DNA模板结合，形成局部________。③延伸（70℃-75℃）：在Taq酶的作用下，从引物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的____________。氢键单链DNA双链DNA链课堂练习（1）用一定的_________切割质粒，使其出现一个切口，露出___________。（2）用_______________切断目的基因，使其产生___________________。（3）将切下的目的基因片段插入质粒的______处，再加入适量________________，形成了一个重组DNA分子（重组质粒）。限制酶黏性末端同一种限制酶相同的黏性末端切口DNA连接酶2、重组质粒形成过程:A.基因枪法B.显微注射法C.农杆菌转化法D.花粉管通道法3、下列哪项不是将目的基因导入植物细胞的方法()B提示：思考与探究答案1.不可以。因为目的基因在表达载体中得到表达并发挥作用，还需要有其他控制元件，如启动子、终止子和标记基因等。2.提示：农杆菌可分为根瘤农杆菌和发根农杆菌，在植物基因工程中以根瘤农杆菌的Ti质粒介导的遗传转化最多。根瘤农杆菌广泛存在于双子叶植物中。据不完全统计，约有93属643种双子叶植物对根瘤农杆菌敏感。裸子植物对该菌也敏感。当这些植物被该菌侵染后会诱发肿瘤。近年来，也有报道该菌对单子叶植物也有侵染能力。3.提示：有些蛋白质肽链上有共价结合的糖链，这些糖链是在内质网和高尔基复合体上加工完成的，内质网和高尔基复合体存在于真核细胞中，大肠杆菌不存在这两种细胞器，因此，在大肠杆菌中生产这种糖蛋白是不可能的。提示：基本操作如下①从小鼠中克隆β-珠蛋白基因的编码序列②将cDNA前接上在大肠杆菌中可以适用的启动子，另外加上抗四环素的基因，构建成一个表达载体。③将表达载体导入无四环素抗性的大肠杆菌中，然后在含有四环素的培养基上培养大肠杆菌。④培养进入了β-珠蛋白基因的大肠杆菌，收集菌体，破碎后从中提取β-珠蛋白。4.